CIENCIAS NUCLEARES
Fagocitosis de suspensiones de fosfato de cromo (III)
Phagocytosis in phosphate chromium (III) suspensions
Jorge Cruz Arencibia, Yoiz Fano Machín, Amed Cruz Morales, Radamés Tamayo Fuente,
José Morín Zorrilla
Centro de Isótopos (CENTIS)
Ave. Monumental y Carretera La Rada, km 3, Guanabacoa. La Habana, Cuba
jcruz@ceniai.inf.cu
RESUMEN
En el trabajo se estudia la fagocitosis in vivo e in vitro de una suspensión de fosfato de cromo (III)
marcada con y
. Las partículas radiactivas, dispersas en un medio de gelatina al 2 % en
buffer acetato de pH 4-4.5, tienen principalmente tamaños entre 0.8 μm y 5 μm. De acuerdo con los
experimentos de distribución biológica en ratas a los 30 minutos se registra una acumulación de radiactividad
cercana al 80 % en hígado, lo que se atribuye a la fagocitosis por las células de Kupffer
de este órgano. También se evidencia que las partículas de la suspensión son fagocitadas in vitro por
macrófagos peritoneales de ratón. Todo ello indica que la suspensión estudiada reúne características
apropiadas para su uso en radiosinoviortesis de acuerdo con el mecanismo principal de acción en
este procedimiento, fagocitosis de las partículas por células presentes en la sinovia inflamada.
Palabras claves: fagocitosis; radiofármacos; fosfatos de cromo; articulaciones de los huesos; enfermedades reumáticas.
ABSTRACT
Phagocytosis in vivo and in vitro of a suspension of chromic phosphate (III) labeled with and
is studied. The radioactive particles dispersed in a media of 2 % gelatin in acetate buffer pH 4-4.5
have a predominant size of 0.8 μm and 5 μm. According with biodistribution experiments in rats after
30 minutes near the 80 % of radioactivity is registered in the liver, probably associated with phagocytosis
of the particles by liver Kupffer cells. Is also showed that the suspension particles are phagocytized
in vitro by mouse peritoneal macrophages. This facts indicate that the studied suspension
have appropriate characteristics to be used in adiosynoviorthesis according to the principal action
mechanism described for this procedure, particles phagocytosis by cells present in the inflamed synovium.
Key words: phagocytosis; radiopharmaceuticals; chromium phosphates; bone joints; rheumatic diseases.
INTRODUCCIÓN
La sinovitis crónica, complicación articular frecuente de artritis reumatoide, hemofilia y otras enfermedades sistémicas, se trata mediante inyecciones intrarticulares de dispersiones radiactivas, procedimiento conocido como radiosinoviortesis (RSV). Esta modalidad terapéutica se realiza de forma ambulatoria y se caracteriza por su elevada tasa de éxito, bajo costo y limitados efectos secundarios [1-3]. Los esfuerzos investigativos se han encaminado a la búsqueda de radiofármacos de alta efi cacia clínica y baja irradiación, principalmente de nódulos linfáticos regionales e hígado, resultado de una distribución uniforme de las partículas inyectadas, depósito de altas dosis en la sinovia dañada, sin afectar el cartílago subyacente y baja o ninguna migración (fuga) articular [4-7]. Un factor clave a estos efectos es el tamaño de las partículas inyectadas, que debe ser lo sufi cientemente pequeño como para que sean fagocitadas por las células presentes en la sinovia infl amada, distribuirse en esta de manera uniforme, evitando excesiva irradiación local y lo suficientemente grande como para que no tenga lugar migración de la articulación y se irradien innecesariamente órganos vecinos [2].
Se han considerado óptimos, tamaños entre 2 μm y
5 μm [8], aunque se han recomendado también tamaños
mayores [2,9]. Los sinoviocitos durante sinovitis pueden
llegar a fagocitar eritrocitos enteros y restos de fi brina,
y la matriz extracelular está expuesta también a la cavidad
[10], lo que favorece la acción de las radiaciones
sobre la sinovia enferma, además de la acción directa
sobre las células que han incorporado las partículas radiactivas.
Como quiera que en el mecanismo principal
se considera la fagocitosis, en el presente trabajo se estima
la capacidad de ser fagocitada suspensiones de
fosfato de cromo (III) marcadas con y
mediante estudios de fagocitosis in vivo e in vitro. El tamaño
predominante de partículas de estas suspensiones está
entre 0.8 μm y 5 μm.
MATERIALES Y MÉTODOS
Las suspensiones marcadas de fosfato de cromo
(III) con más del 90 % de las partículas, con un tamaño
entre 0.8 μm y 5 μm, dispersas en buffer acetato de pH
4- 4.5, se obtuvieron según la metodología descrita en
[11]. La distribución biológica se estudió inyectando en
la vena dorso lateral de la cola de ratones OF-1, de 20 g
a 30 g de peso, suministrados por el Centro para la Producción
de Animales de Laboratorio (CENPALAB) de
Cuba; 0.2 mL de la suspensión marcada con , resultado
de diluir 1 mL de la suspensión original en 5 mL de
solución de gelatina en tampón acetato. El ensayo se
realizó en 5 animales y la dispersión se agitó fuertemente
antes de la administración. Los conteos de actividad
de las jeringas se registraron antes y después de la inyección.
Los ratones se sacrifi caron a los 30 minutos
mediante extracción de sangre por punción cardiaca.
Se colectaron sangre, hígado, bazo, pulmones, riñones,
fémur y músculo, así como la cola y orina (en papel absorbente
colocado en la jaula en la que se confi naron los
animales). Las mediciones se realizaron en contador LB
2040 (Berthold) con detector de NaI(Tl) calibrado para
. El cálculo de las dosis administradas y acumuladas
se hizo con ayuda del programa Biodist, en plataforma
de Microsoft Excel. Las hojas de cálculo se diseñaron
para la entrada directa de los datos: actividad de las
jeringuillas llenas y vacías, actividad de las muestras y
de una dilución estándar de referencia y fecha, y hora
de medición de cada muestra. El programa da como resultado
los porcentajes de captación por masa de tejido
(%D/g) [DCC.PNO.033, 2004].
En el caso de la sangre, para calcular la dosis total
acumulada, se asumió que representa el 7.4 % del
peso del animal [12]. Para los ensayos de fagocitosis in
vitro se utilizaron macrófagos de rata obtenidos a partir
de fluido peritoneal extraído cuatro días después de
una inyección intraperitoneal de 1 mL de solución de
tioglicolato al 3 % (Merck, Alemania) [13]. Una vez lavadas,
las células se resuspendieron en solución salina
balanceada de Hank a una concentración de 2 x células/mL. La suspensión de macrófagos peritoneales
se colocó en tubos Lp3 (200 μL por tubo) y se incubó
durante dos horas a 37 °C. Las células no adheridas
se eliminaron por lavado con solución salina 0.9 %. La
capa de macrófagos adherida se cubrió con 400 μL de
suspensión de partículas de
en medio de cultivo
DMEM (Dulbbeco’s Modified Eagle Médium, Gibco
BRL, EE.UU), al que se le añadió un suplemento de suero
bovino fetal, L-glutamina y una mezcla de antibióticos
al 1 %. Se realizaron cinco series de experimentos en
las que se evaluaron cinco concentraciones de partículas
obtenidas por diluciones sucesivas de la suspensión,
desde 1:2 hasta 1:48. Después de la incubación durante
18 h a 37 °C (Incubadora Jouan IG 150, Francia), se midió
la actividad a cada uno de los tubos (actividad inicial,
). A cada tubo se añadió 1 mL de solución de NaCl
0.9 % y se descartó el sobrenadante. Los tubos se lavaron
2 veces con 1 mL de solución salina 0.9 % y se secaron
sobre papel absorbente. Posteriormente se midió
la actividad que permaneció en los tubos (actividad final,
) y se calculó el porcentaje de actividad retenida mediante
la relación (
/
) x100. El por ciento de actividad
retenida en los tubos de manera inespecífi ca se calculó
a través de la medición de la actividad que permaneció
unida a tubos que no contenían células. Las mediciones
se realizaron en contador LB 2040 (Berthold) con detector
de NaI(Tl) calibrado para
.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados de la distribución biológica en ratones y los del estudio de fagocitosis se muestran en las tablas 1 y 2.
Como se aprecia en la tabla 1, cerca del 80 % de
la dosis inyectada se registra en hígado y bazo. La baja
retención en pulmones (3.8 %) permite afirmar que la
fracción más abundante tiene un tamaño menor de
10 μm, pues se conoce que las partículas con tamaños
mayores de 10 μm son retenidas por los capilares
pulmonares [3,14]. Los datos de distribución biológica
de otras dispersiones de fosfato de cromo (III) indican
que cuando se administran por vía endovenosa preparaciones
con tamaños de partículas entre 0.1 μm
y 1 μm, estas son rápidamente aclaradas en sangre y
fagocitadas por hígado y bazo [14-19]. Si se usa vía
intracavitaria (principalmente intraperitoneal) las soluciones
coloidales alcanzan también estos órganos del
Sistema Retículo Endotelial (SER), no así si se inyectan
suspensiones (de mayores tamaños de partículas) dada
la dificultad en la migración por vía linfática. La observación de una acumulación rápida y persistente en hueso,
principalmente en médula ósea, seguida sobre todo de
inyección intracavitaria, indica también que se deben
extremar los cuidados en el uso terapéutico del fosfato
de cromo (III)- de pequeños tamaños de partículas.
Esto puede acentuar el riesgo del efecto deletéreo de
una irradiación prolongada a médula ósea por partículas
beta de difícil detección por rastreo centelleográfi co superfi
cial [14-19]. El empleo de macroagregados de albúmina
sérica humana con tamaños predominantes entre
0.5 μm y 2.0 μm ha evidenciado fagocitosis por parte
de las células de Kupffer del hígado, indicándose que
aproximadamente el 65 % se acumula en ese órgano a
los 4 min después de la inyección [20]. Las evidencias
y resultados de la distribución biológica indican que las
uspensiones tienen tamaños que favorecen su fagocitosis.
Como elemento de comprobación de este importante
hallazgo se empleó un modelo in vitro a partir de
macrófagos obtenidos en el fl uido peritoneal de ratas
[13]. En la bibliografía especializada no se encontraron
estudios de fagocitosis in vitro de los radiofármacos
aprobados actualmente para uso en RSV. En un experimento
inicial orientativo se demostró la existencia de
retención de las partículas en presencia de células tipo
macrófago, estadísticamente diferente de la retención
inespecífica (en ausencia de células), lo que permite
afi rmar que la retención se debe a la interacción partículas-
células. En experimentos posteriores se demostró
que la retención varía al disminuir la concentración
de las partículas (tabla 2), con un aumento de la actividad
retenida y, por lo tanto, de las que son fagocitadas.
Como la retención está expresada en porcentaje, este
resulta mayor con un menor número de partículas, lo
que apoya la idea de la fagocitosis en lugar de otro tipo
de interacción. Estos resultados evidencian que las partículas
de fosfato de cromo (III) obtenidas por el procedimiento
establecido, con un tamaño mayoritario entre
0.8 μm y 5 μm, son fagocitadas por células del SRE del
hígado al ser inyectadas en ratones y por macrófagos
peritoneales aislados de rata, lo que permite considerar
se comporten de manera similar in vivo. Es presumible
por tanto, que los radiofármacos de fosfato de cromo
(III) marcados con adecuados emisores beta (
) en
particular, sean efi caces en el tratamiento de sinovitis
crónica mediante RSV.
CONCLUSIONES
Las suspensiones de fosfato de cromo (III) marcado
con , con tamaño predominante de partículas entre
0.8 μm y 5 μm, se acumulan cerca de un 80 % en hígado
de ratas. Ello es atribuible a fagocitosis por las células
del SER de este órgano, presumiblemente células
de Kupffer. Marcado con
, el producto es asimismo
fagocitado in vitro por macrófagos peritoneales de ratón.
Ello hace a estas suspensiones marcadas con un
radionúclido apropiado como
, potencialmente eficaces
para su uso en radiosinoviortesis.
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Recibido: 2 de diciembre de 2014
Aceptado: 23 de abril de 2015