CIENCIAS NUCLEARES
Caracterización
de la formulación de -Macroagregados
de albúmina
Characterization
of -
macroaggregates formulation
Alejandro Rivero Santamaría 1 , Yumisley Alfonso Marín 2 , Francisco Zayas Crespo 2 , Niurka Mesa Dueñas 2 , Rolando Rodríguez Fernandez 2
1 Instituto Superior
de Tecnologías y Ciencias Aplicadas (InSTEC) Ave. Salvador Allende, esq.
Luaces, Plaza, Ciudad de La Habana, Cuba
2 Instituto de Nefrología (INEF) "Abelardo Buch López"
arivero@instec.cu
RESUMEN
En este trabajo
se realizó la caracterización del proceso de formación
y marcaje de los macroagregados de albúmina (MAA) con .
Con este fin se efectuaron estudios comparativos para establecer el papel de
la desnaturalización en presencia del
durante la formulación de
-Sn-MAA,
para ello se utilizaron tres formulaciones. Se realizó un análisis
estructural cualitativo de la albúmina sérica humana para describir
el sistema a través de un modelo gráfico. Los resultados mostraron
diferencias importantes en el comportamiento radioquímico de las tres
formulaciones. La formulación de
-Sn-MAA
(A) mostró un comportamiento superior, con purezas radioquímicas
cercanas a 95% en los tiempos estudiados y una disociación inferior al
20% en 24 h.El modelo gráfico permitió explicar, a través
de sencillas representaciones, los procesos involucrados en el sistema estudiado,
permitiendo una mejor comprensión de este.
ABSTRACT
The aim of this
paper was to study the formation and radiolabelling of 99m Tcalbumin macroaggregates.
Comparatives studies of three formulations to establish the role of denaturalization
and
in the formulation of
-Sn-MAA
were carried out. A qualitative structural analysis of human serum albumin was
performed in order to give a description of the studied system using a graph
model. The results showed important differences in the radiochemical behavior
of the three formulations.
-Sn-MAA
(A) formulation had the best behavior, with radiochemical purity close to 95%
and dissociation below 20% after 24 h of being radiolabeled. The graph model
explained with simple representations the process involved in the studied system;thus
allowing a better knowledge of it.
Key words: albumins,
technetium 99, labelling, tin, comparative evaluations, centrifugation, chromatography,
protein denaturation
1. Introducción
El uso de radiofármacos
basados en la albúmina sérica humana (ASH) para evaluar la perfusión
pulmonar se remonta a 1963. En ese año Taplin y col. [1] utilizaron la
ASH como materia prima y desarrollaron macroagregados de albúmina (MAA)
marcados con
(
-MAA).
Tres años después en 1966, Paoli y cols. [2] formularon por primera
vez el
-MAA,
que en corto tiempo se establecería como el radiofármaco de elección
para evaluar la perfusión pulmonar.
En la actualidad y a pesar del desarrollo de técnicas como la Tomografía Axial Computarizada (TAC) y la Resonancia Magnética Nuclear (RMN), se continúa utilizando la gammagrafía pulmonar en el diagnóstico del tromboembolismo pulmonar [3].
La producción
y marcaje de los MAA se realiza desde el siglo pasado y su aplicación
médica es muy conocida. Las premisas en su formulación parten
de la obtención de una suspensión de partículas marcadas
con el tamaño apropiado que permitan la visualización mediante
gammagrafía de la perfusión pulmonar. Sin embargo, muchos de los
factores que intervienen en el mecanismo de formación de los MAA a partir
de la ASH y que pueden condicionar su comportamiento ante el marcaje con
no han sido estudiados o dilucidados.
Este trabajo tiene
como objetivo estudiar el sistema ASH- -MAA
con el fin de demostrar que el proceso de desnaturalización en presencia
de
de la ASH es determinante en el comportamiento radioquímico de los
-MAA.
2. Materiales y métodos
2.1 Materiales
Los experimentos
realizados se llevaron a cabo con solución de ASH al 20%, suministrada
por el Centro de Hemoderivados de Ciudad de La Habana. La solución de
-pertecnectato
de sodio fue suministrada por el Centro de Isotopos (CENTIS). Los demás
reactivos utilizados fueron de calidad analítica.
2.2 Preparación
Se prepararon tres
soluciones de concentraciones 2 mg/mL de ASH y 20 mg/mL de acetato de sodio
en 25 mL de volumen final. Dos de ellas contenían 0,14 mg/ml de
(solución A y solución C). La otra no
contenía
. (solución B). En todos los casos el pH final fue 5,5.
Las tres soluciones se filtraron a través de un filtro 0,22 µm a frascos estériles de 30 mL. Los frascos que contenían las soluciones A y B se sometieron a un proceso de desnaturalización controlada en un baño de agua a 78°C y agitación circular de 200 rpm durante 8 min.
La mezcla obtenida tras la desnaturalización térmica fue centrifugada a 800 rpm durante 15 min. Concluida la centrifugación se extrajo el sobrenadante y se enrasó a 25 mL con SSFE. Por último, se dispensó 1 mL de la suspensión de MAA en frascos estériles y se almacenaron a 4°C.
El frasco que contenía C fue agitado durante 8 min a 200 rpm, concluida la centrifugación se dispensaron frascos estériles que contenían 1 mL de la mezcla y se almacenaron a 4°C
2.3 Radiomarcación
La radiomarcación
se realizó añadiendo 370 MBq de
, a los frascos que contenían 1 mL de las mezclas A (
-Sn-MAA),
B (
-MAA)
y C (
-Sn-
ASH).
2.4 Controles de calidad
2.4.1 Control
de la pureza radioquímica -Sn-MAA
La determinación
de la pureza radioquímica se realizó combinando la cromatografía
de papel ascendente (CPA) para la determinación del
libre y la centrifugación para la determinación de
-
MAA,
-Sn-coloidal,
-MiA
[4] [5].
Se aplicó
1 µL de -Sn-MAA
sobre tiras de papel (0,5 x 5
) Whatman N°1 y se desarrollaron utilizando SSFE y acetona como solventes.
Terminado el desarrollo del cromatograma se secaron las tiras en una estufa
a 80°C. A continuación se cortaron por el punto medio y se contó
la radiactividad de cada fracción de papel en un contador gamma automático
(Clinigamma 1272, LKB-Wallac). Los resultados se expresaron como porcentaje
de la radiactividad asociada al punto de aplicación.
Se mezclaron 200
µL de -Sn-MAA
con 1,5 mL de SSFE en un vial, se agitó y centrifugó a 800 rpm
por 15 min, se midió la radiactividad total del vial, se extrajo el sobrenadante
y se volvió a medir en ambos casos utilizando un calibrador de dosis
(CAPINTEC). Los resultados se expresaron como porcentaje de la radiactividad
asociada al centrifugado.
Se realizó un estudio de cinética de marcaje y estabilidad en el tiempo. Para esto se determinó la pureza radioquímica transcurridos 15 seg, 2, 5, 10, 20 y 30 minutos, 3 horas y 24 horas.
2.4.2 Control
de la pureza radioquímica -Sn-ASH
La determinación de la pureza radioquímica se realizó combinando la cromatografía de papel ascendente (CPA) utilizando Whatman N° 1 y la cromatografía en columna con geles de Sephadex [6] [7].
Se aplicó
1 µL de -Sn-ASH
sobre tiras de papel (0,5 x 5 cm 2 ) Whatman N° 1 y se desarrollaron utilizando
SSFE y acetona como solventes. A continuación se siguió el procedimiento
descrito en el epígrafe 2.4.1.
La determinación de la fracción de radiocoloides presente en la formulación se efectuó por medio de cromatografía en columna en gel de Sephadex G-25 M. Con este fin se utilizó una columna comercial PD-10 (Pharmacia) o su equivalente hecha en el propio laboratorio. Se aplicó sobre la columna cerrada un volumen de radiofármaco que contenía 5,5-7,4 MBq y se midió la radiactividad en un activímetro. Seguidamente se quitó el tapón del fondo de la columna y se lavó con 20 mL de SSFE. Terminado el lavado y con la columna seca, se tapó nuevamente esta, y se determinó la radiactividad residual, la que se expresó en porcentaje de la radiactividad inicial.
Se realizó un estudio de cinética de marcaje y estabilidad en el tiempo según lo descrito en el epígrafe 2.4.1.
2.4.3 Estudio
de la fortaleza del enlace -Sn-MAA
y
-ASH
Se tomaron alícuotas de 0,1 mL de cada radiofármaco equivalentes a 300 µg de proteína y se pusieron en contacto con 0,9 mL de sangre total. Las mezclas se agitaron y a continuación se incubaron durante 24 horas a 37°C. Transcurridas las primeras 3 horas se tomaron muestras para desarrollar CPA en SSFE, seguidamente se determinó el porcentaje de radiactividad asociado al frente del cromatograma, al cual correspondió el porcentaje de disociación del producto en el medio. Este procedimiento se repitió a las 24 horas.
3. Resultados y Discusión
3.1 Papel de
la desnaturalización en el marcaje con .
Comparación A y C
Los resultados
del estudio de la cinética y estabilidad del marcaje mostraron que existen
apreciables diferencias en el comportamiento ante el marcaje con
de ambas formulaciones.
La figura 1 muestra
que a los 15 segundos, aproximadamente 95% de la actividad está enlazada
a la formulación A ( -Sn-MAA),
y este valor se mantiene estable durante 24 h. Este resultado demuestra que
el proceso de marcaje de los MAA con
es extremadamente rápido y su estabilidad en el tiempo es elevada. La
literatura existente no reporta estudios de este tipo para tiempos como los
mostrados. Sin embargo, los resultados a 30 min, 3 y 24 h coinciden con los
reportados por numerosos autores [8] [4] [9], teniendo en cuenta que en nuestro
estudio la pureza radioquímica considera para su cálculo los porcentajes
de
-Sn-coloidal
y
-
Microagregados además del
libre, ya que los dos primeros no se tuvieron en cuenta en la generalidad de
los reportes, pues se aplican procedimientos de control de calidad que no separan
a estas impurezas radioquímicas del
-Sn-MAA
El valor de la
pureza radioquímica de la formulación C ( -Sn-ASH)
a los 15 segundos es aproxima- damente 59%, que aumenta progresivamente hasta
alcanzar un máximo de 77% a los 30 min y posteriormente disminuye lentamente
en un periodo de 20 horas manteniéndose a las 24 horas 70% de proteína
marcada.
Estos resultados
indican que el proceso de desnaturalización al que se somete la ASH para
la producción de MAA es determinante en el comportamiento de estos una
vez marcados con .
La expresión de nuevos sitios de coordinación debido al desplegamiento
irreversible de la proteína a 78°C [10], influye significativamente
en que se produzca una rápida incorporación del
reducido a la proteína desnaturalizada.
El comportamiento
de la proteína en su estado nativo es completamente diferente debido
a la existencia de menos sitios disponibles para enlazar al
reducido lo que provoca un marcaje más lento y favorece la generación
de impurezas radioquímicas como el
y
el
-Sn-coloidal.
3.1.2 Fortaleza
de enlace
Los estudios de incubación «in vitro» con sangre total de las formulaciones marcadas reafirmaron los resultados del estudio cinético.
La tabla 1 muestra
que a los 30 min el porcentaje de disociación de la formulación
de -Sn-MAA
es muy pequeño y solo equivale aproximadamente al 5% de la actividad
enlazada, a las 24 h la disociación alcanzó un valor de 17%, en
ambos casos los valores coincidieron con los reportados por Hunt y cols. [4]
los cuales refieren una disociación de 4% y 17% a los 30 min y 24 h respectivamente
después de marcados los MAA.
El comportamiento
de la ASH marcada mostró una disociación elevada de la formulación
a los 30 min después de incubadas las muestras. Este resultado indica
que el enlace -reducido-ASH
es más débil y por ello se favorece en una mayor magnitud la transquelación
hacia los agentes quelatantes presentes en la sangre humana.
En cambio para
el -Sn-MAA,
los pequeños valores de disociación señalan que los enlaces
-
reducido-Sn-MAA poseen una fortaleza mayor, debido posiblemente a que se involucran
una mayor diversidad de sitios de coordinación fuertes, originados durante
el proceso de desnaturalización a través de la exposición
de nuevos sitios potenciales para el enlace del radisótopo, confiriéndole
al enlace 99m Tc-MAA mayor fortaleza y estabilidad.
3.2 Papel del
estaño en la formulación de -Sn-MAA.
Comparación A y B
3.2.1 Cinética
de marcaje
El estudio comparativo
realizado para evaluar la importancia de la presencia del
durante el proceso de desnaturalización de la HSA y el marcaje de los
MAA, indicó que existían diferencias apreciables en el comportamiento
de las dos formulaciones estudiadas.
La figura 2 muestra
que la formulación que no incluyó el Sn inicialmente en el proceso
de desnaturalización alcanzó a los 15 s una pureza radioquímica
de 87%, valor que resultó diferente al obtenido con la otra formulación
la cual alcanzó un valor de 94% en el mismo tiempo. En el intervalo de
0-5 min se observa un crecimiento similar de la pureza radioquímica de
ambas formulaciones, sin embargo, en el intervalo de 5-30 min se produce un
decrecimiento apreciable de este parámetro para la formulación
-
MAA sin Sn, comportamiento que se mantiene hasta alcanzar a las 24 h un valor
de 72%. La otra formulación mostró una estabilidad elevada en
el tiempo, manteniéndose esta durante las 24 h, oscilando entre 93-96%.
Estos resultados
demuestran que la presencia de
en el proceso de desnaturalización de la ASH es fundamental para la obtención
de formulaciones con elevada pureza radioquímica y estables en el tiempo.
Además indican que la cantidad de sitios disponibles para coordinar el
es menor cuando el
no participa en la desnaturalización por lo que la cantidad de impurezas
coloidales y
aumenta considerablemente generando un radiofármaco de inferior calidad.
A este hecho se
refieren en la patente norteamericana 6730286 «Manufacturing process
to control particle size» [5], donde los autores plantean que la presencia
de
en el proceso previo a la desnaturalización debe disminuir las posibilidades
de que este ion se oxide, además de permitir que el
se incorpore dentro de la estructura interna y externa del MAA, permitiendo
la obtención de un radiofármaco de mayor calidad.
3.2.2. Fortaleza de enlace
Los resultados de esta comparación reafirmaron los datos obtenidos en el estudio cinético.
La tabla 2 muestra
las diferencias notables que existen en el comportamiento de una y otra formulación.
La disociación de la formulación donde no se incluyó el
en el proceso de desnatu ralización mostró una disociación
de 41% a los 30 min, valor apreciablemente diferente al obtenido con la otra
formulación que solo se disoció en 5% en el mismo tiempo. Ambas
formulaciones continuaron disociándose en el transcurso del tiempo pero
la formulación
-MAA
sin
presentó un crecimiento mucho más acelerado llegando a 65% a las
24 h de comenzado el experimento, valor que contrasta con 17% obtenido en la
formulación
-MAA.
Este resultado
confirma que el enlace del
reducido a los sitios de coordinación en los MAA está menos favorecido
cuando el
no se incluye en el proceso de desnaturalización, además, que
este es más débil y menos estable, lo que implica que en presencia
de agentes quelatantes la disociación se produce fácilmente.
3.3 Análisis
estructural molecular cualitativo de la ASH
La ASH es una proteína cuya estructura es mayormente helicoidal por lo que un análisis de su estructura primaria (secuencia lineal de aminoácidos) puede proveer datos bastante cercanos sobre la distribución de los sitios cargados en la molécula nativa.
Aunque el proceso de desnaturalización de proteínas ocurre de forma compleja, generándose múltiples arreglos de la proteína desnaturalizada, para la ASH el proceso transcurre a través de un desplegamiento progresivo de los dominios de la proteína nativa a medida que aumenta la temperatura alcanzándose el desplegamiento irreversible a T>75°C.
Es por esta causa que la distribución de los cluster cargados en la estructura primaria de aminoácidos de la proteína, antes de la desnaturalización, debiera ser bastante cercana a la distribución tras la desnaturalización, ya que el desplegamiento no separaría a la gran mayoría de estos cluster.
Partiendo de este hecho se construyó un gráfico de distribución de cargas según la posición en la secuencia lineal de aminoácidos de la proteína nativa.
La figura 3 muestra
una prevalencia de sitios de coordinación negativos en la proteína,
la cual se debe acentuar a un pH por encima del punto isoeléctrico. Este
hecho explicaría por qué cuando el
está presente en la solución inicial de ASH disminuye la posibilidad
de que este se oxide [5] pues se produciría un enlazamiento temprano
del
a los sitios de coordinación negativos presentes en la proteína,
a través de un proceso que implicaría el traspaso del
enlazado al acetato presente en el medio hacia los sitios de coordinación
de la ASH, garantizando que la mayoría del Sn se conserve en su estado
reductor en esta primera etapa.
La ASH posee,además, 17 puentes disulfuros. Esta cantidad de puentes favorece el proceso de agregación, ya que tras el sometimiento de la proteína a T = 78° C estos se rompen, dando lugar a la formación de grupos –SH libres los cuales interaccionan generando nuevos enlaces S-S entre proteínas desnaturalizadas y de esta manera forman los agregados moleculares.
La presencia de
en este proceso debe favorecer la formación de los grupos -SH debido
al carácter reductor del
, acentuado este efecto a la temperatura en la que se trabaja, así como
su coordinación en algunos de estos grupos –SH libres que no participan
directamente en el proceso de agregación molecular.
3.4 Modelo propuesto
3.4.1 Primera etapa. Preparación de la solución
La ASH en su estado
nativo en solución de acetato de sodio y
a un pH = 5,5, es capaz de coordinar átomos de
utilizando los sitios nucleofílicos presentes en su superficie molecular.
El proceso debe
transcurrir por la transferencia del Sn en su forma reducida ()
del complejo Sn-Acetato hacia complejos de forma
-
o
+
-COO - ,
-SH y
+
-OH en la superficie de la proteína.
3.4.2 Segunda
etapa. Desnaturalización
La temperatura
utilizada para la formulación T = 78°C garantiza que la proteína
desarrolle un desplegamiento irreversible, de modo que se expresan nuevos sitios
de coordinación que anteriormente no existían, ya que se encontraban
en su estructura interna (sitios hidrofóbicos). Estos nuevos sitios de
coordinación pueden completar el acomplejamiento del
presente en la solución que se encuentra aún en forma de complejo
-Acetato.
Esta etapa sería
determinante en el posterior comportamiento de los MAA frente al ,
pues la presencia del
garantiza que este se acompleje en todos los sitios de coordinación disponibles
de la estructura de los MAA, es decir, tanto en los sitios inicialmente internos
como en los sitios de coordinación en la superficie. Si el
no está presente durante el proceso de desnaturalización, el enlazamiento
posterior de este al MAA estará limitado a los sitios de coordinación
en la superficie de estos últimos, debido a los impedimentos que pueden
surgir causados por la estructura extremadamente compleja del MAA.
También
hay que señalar que en esta etapa el
juega un papel importante en el rompimiento de algunos de los puentes disulfuros,
generando sitios adicionales para la agregación de las proteínas
y para la coordinación de otros átomos de
en forma de
-S.
3.4.3 Tercera etapa. Marcaje
Una vez incorporado
el
al kit formulado, el
coordinado en los MAA reduce rápidamente al
a estados positivos según la siguiente ecuación:
Después de esta reducción, el
en su forma de ion positivo ocuparía los sitios de coordinación
que el Sn después de oxidado puede dejar libre. Sin embargo, también
podría suceder una competencia entre el
y el Tc-reducido por los centros disponibles para la coordinación e incluso
podrían subsistir ambos metales en el complejo como plantean algunos
autores [11] [12].
Nuestros resultados
nos llevan a afirmar que de cualquier forma que suceda este proceso, la presencia
de
coordinado a los sitios nucleofílicos de la proteína disminuye
notablemente la posibilidad de que aparezcan impurezas coloidales de
o que subsista alguna cantidad
reoxidado. Al parecer, en el mismo lugar que se reduce el
se produce la coordinación del
reducido a los MAA, lográndose un marcaje rápido y estable.
Además la
presencia del
en toda la estructura del MAA garantiza que los enlaces con el
sean fuertes debido a que muchos de estos se encontrarán en el interior
de la estructura del MAA, disminuyendo de esta forma la posibilidad de interacción
con agentes quelatantes que pudieran competir por el
reducido.
4. Conclusiones
A partir de nuestros
resultados y el análisis realizado podemos concluir que los cambios que
se producen en el proceso de desnaturalización controlada de la ASH le
confieren al MAA propiedades que favorecen su marcaje con .
Además, que la presencia del
desde el inicio del proceso de formulación de los MAA propicia que el
marcaje de estos sea de una elevada calidad.
En este trabajo también se propuso un modelo teniendo en cuenta las características estructurales de la ASH que facilita la comprensión de los procesos involucrados en este sistema complejo y explica de forma sencilla los resultados de los estudios experimentales realizados.
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Recibido: 17 de
febrero de 2009
Aceptado: 14 de mayo de 2009