Avances en la aplicación de la radiomutagénesis in vitro para el mejoramiento genético de portainjertos cítricos

1. Protocolo de radiomutagénesis y propagación in vitro de portainjertos cítricos basado en organogénesis adventicia:

En un estudio previo, se estableció un protocolo de radiomutagénesis y micropropagación in vitro basado en organogénesis adventicia en el portainjertos citrume-lo Swingle [10[10] ÁLVAREZ A., MARTÍNEZ A, ZAMORA V, et. al. Comparación de dos protocolos de radiomutagénesis in vitro para el portainjertos cítrico citrumelo Swingle. Cultivos Tropicales. 2022; 43(1): p.07. ]. A partir de este protocolo, se comparó su eficiencia ente cuatro portainjertos (citrumelo Swingle, Citrus macrophylla, Citrus aurantium y mandarina Cleopatra). Se establecieron las dosis mutagénicas de Cobalto 60 (⁶⁰Co) y se comparó la brotación, el enraizamiento y la adaptación a sustrato.

2. Esquema de selección in vitro de tolerancia a sequía:

Se obtuvieron vitroplantas de los portainjertos citrange Carrizo, Citrus macrophylla y mandarina Cleopatra, obtenidas según [10[10] ÁLVAREZ A., MARTÍNEZ A, ZAMORA V, et. al. Comparación de dos protocolos de radiomutagénesis in vitro para el portainjertos cítrico citrumelo Swingle. Cultivos Tropicales. 2022; 43(1): p.07. ] y se subcultivaron in vitro por seis meses hasta tener como mínimo dos entrenudos y cinco hojas desarrolladas. Estas se sometieron a tres tratamientos: medio Murashige-Skoog (MS) con un 0 (control), 10, 20 y 30 % de polietilenglicol (PEG-6000) durante 14 días. Las curvas dosis-efecto se desarrollaron considerando el porciento de supervivencia a los 30 días de retirado el estrés, en 15 vitroplantas por tratamiento. Se evaluaron ocho caracteres morfofisiológicos (altura de la planta, largo de la raíz, número de hojas, necrosis foliar, necrosis del ápice del brote, oscurecimiento radicular, necrosis del ápice radicular y estrechamiento de las raíces) y se comparó el índice de tolerancia relativo (ITR) de los mismos [11[11] GONZÁLEZ CEPERO MC & MARTÍNEZ ROMERO A. Selección de mutantes de arroz de buen comportamiento agronómico en condiciones de bajo suministro de agua. Cultivos Tropicales. 2016; 37(1): 102-109. ] a los 14 días, respecto al control.

3. Esquema de selección in vitro de posible tolerancia a alcalinidad:

Los ensayos se desarrollaron en vitroplantas de citrumelo Swingle obtenidas como se indica en el acápite anterior, las que se sometieron por 30 días a tres tratamientos selectivos: control (C), intermedio (½ Fe) y deficiente de hierro (0 Fe); consistentes en MS, MS conteniendo la mitad de la concentración de las sales de hierro y MS basal sin sales de hierro, respectivamente [12[12] MARTÍNEZ CUENCA M.R., QUIÑONES A., FORNER GINER MA. Screening of ‘King’ mandarin (Citrus reticulata Blanco) × Poncirus trifoliata ((L.) Raf.) hybrids as citrus rootstocks tolerants to iron chlorosis. 2016. Scientia Horticulturae. 2016; 198: 61-69. doi: 10.1016/j.scienta.2015.10.038.]. Se utilizaron 15 vitroplantas por tratamiento, considerando la supervivencia a los 30 días de retirado el estrés. A los 7, 14, 21 y 28 días de estrés, se evaluaron seis caracteres morfofisiológicos (altura de la planta, número de hojas, número y largo promedio de las raíces y porcentaje de enraizamiento secundario). El grado de clorosis en las hojas se determinó como el número de hojas con síntomas de clorosis, del total.

4. Líneas mutantes:

Se desarrollaron tres lotes de líneas mutantes de Citrus macrophylla, Citrus aurantium, citrange Carrizo y citrumelo Swingle seleccionadas in vitro frente a estrés hídrico. El lote 1 (L1) fue aclimatado y adaptado a sus-trato según el protocolo establecido [10[10] ÁLVAREZ A., MARTÍNEZ A, ZAMORA V, et. al. Comparación de dos protocolos de radiomutagénesis in vitro para el portainjertos cítrico citrumelo Swingle. Cultivos Tropicales. 2022; 43(1): p.07. ] y los lotes L2 y L3 fueron injertados para acelerar su propagación clonal y su entrada en fase productiva. En diciembre de 2020 se sembraron 39 líneas mutantes en parcela experimental J-10, de la UCTB “Félix Duque”, Jagüey Grande, Matanzas. Cada seis meses se evaluaron variables del crecimiento como la altura de la planta, la relación diámetro altura (D/A), el largo promedio de los entrenudos (LE) y se realizaron evaluaciones fitosanitarias.

5. Análisis de los datos:

Las curvas dosis-efecto se obtuvieron por ajuste de los valores medios en Origin-PC, a partir de un diseño experimental completamente aleatorizado. Se calculó la media, desviación estándar y error estándar de cada carácter evaluado y se determinó el ajuste a la normalidad y la homogeneidad de varianza por las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Levene, respectivamente. Se aplicaron las pruebas de comparación de medias correspondientes (SPSS V19) y los porcentajes se compararon con una prueba de Chi cuadrado (χ2) de comparación de proporciones (Statgraphics Plus V5.1).

1. Protocolo de radiomutagénesis in vitro basado en organogénesis adventicia en tres portainjertos cítricos:

A partir de las curvas de radiosensibilidad se determinaron las dosis mutagénicas para segmentos de epicótilo de cada portainjertos (tabla 1). Excepto para citrumelo Swingle, que resultó más radiorresistente (DL₅₀=45 Gy); la radiosensiblidad fue similar para los restantes portainjertos, con DL₅₀ entre 26 y 29 Gy. Estos valores están en el rango informado para especies cítricas como la mandarinas Fremont, el tangor Murcott y la lima Rangpur (de 22 a 34,5 Gy) [13[13] GONZAGA DL, LATADO RR, TULMAN NA, PIO RM. Radiosensibilidade de dois tipos de propagulos de citros. Bragantia, Campinas. 2011; 70(1): 13-18.]. Aunque se considera que DL₅₀ (±10 %) garantiza la mayor frecuencia de mutaciones; en nuestros trabajos se recomendó una dosis intermedia que permite inducir mutaciones sin un alto grado de daños deletéreos. En este caso, la dosis que reduce en un 30 % la supervivencia (DL₃₀).

Al utilizar 2,0 mg L-1 de 6-bencilaminopurina (6-BAP) según el protocolo establecido [1[1] KHARKWAL MC. History of plant mutation breeding and global impact of mutant varieties. In: Mutation Breeding for Sustainable Food Production and Climate Resilience. Singapore: Springer, 2023. p. 25-55. Disponible en: https://doi.org/10.1007/978-981-16-9720-3_2 ], se observaron los mayores valores de brotación adventicia (97 y 90 %) para citrumelo Swingle y Citrus macrophylla, respectivamente; un 87 % para mandarina Cleopatra y el valor más bajo, para Citrus aurantium (68 %). Al evaluar los tratamientos de enraizamiento [1[1] KHARKWAL MC. History of plant mutation breeding and global impact of mutant varieties. In: Mutation Breeding for Sustainable Food Production and Climate Resilience. Singapore: Springer, 2023. p. 25-55. Disponible en: https://doi.org/10.1007/978-981-16-9720-3_2 ], se obtuvieron los mayores porcentajes y número de raíces por explante en MS suplementado con ácido 1-naftilacético (ANA) para todos los portainjertos, excepto para mandarina Cleopatra que no mostró diferencias entre tratamientos (figura 1). En el caso de citrumelo Swingle, se observó un mayor número de raíces primarias y de mayor longitud en el medio de suplementado con ácido 4-3 indolbutírico (AIB), sin embargo, a partir de los 30 días se observó un enraizamiento secundario, que alcanzó un valor significativo (92 %) a los 60 días en el medio suplementado con ANA [1[1] KHARKWAL MC. History of plant mutation breeding and global impact of mutant varieties. In: Mutation Breeding for Sustainable Food Production and Climate Resilience. Singapore: Springer, 2023. p. 25-55. Disponible en: https://doi.org/10.1007/978-981-16-9720-3_2 ]. En general, el mejor comportamiento del enraizamiento en medio suplementado con ANA estuvo en correspondencia con otros estudios en Citrus spp. [14[14] KUMAR K, GILL MIS, GOSAL SS. Somatic Embryogenesis, in vitro selection and plantlet regeneration for citrus improvement. In: Biotechnologies of crop improvement. Vol 1. 2018. p. 373-406. ]. La adaptación a sustrato estuvo en correspondencia con el grado de enraizamiento previamente obtenido para cada portainjertos. Así, se obtuvo un 92, 62, 60, y 55 % de adaptación a sustrato para citrumelo Swingle, mandarina Cleopatra, Citrus aurantium y Citrus macrophylla, respectivamente. Tanto para la brotación como para el enraizamiento, la variación en la respuesta estuvo determinada por el genotipo, indicando que, aunque el protocolo de organogénesis adventicia establecido puede ser aplicado en los portainjertos estudiados con un determinado grado de eficiencia, son necesarios estudios adicionales con diferentes concentraciones o combinaciones de reguladores del crecimiento para alcanzar la respuesta óptima de cada genotipo en las diferentes etapas del mismo.

2. Selección in vitro de posible tolerancia a la sequía:

Con el análisis de las curvas dosis-efecto, se pudo observar una menor supervivencia de citrange Carrizo, mientras la mayor tolerancia se observó en las vitroplantas de m. Cleopatra, en correspondencia con su comportamiento diferencial frente a la sequía (figura 2). A partir de las curvas dosis efecto, se obtuvieron DL₅₀ de 15, 17 y 30 % de PEG-6000 para citrange Carrizo, Citrus macrophylla y mandarina Cleopatra, respectivamente. Considerando los valores obtenidos en este estudio, para los futuros esquemas de mejoramiento, se determinó aplicar dosis selectivas iguales o superiores a la DL₅₀ del genotipo más susceptible. Por ello, en los lotes de líneas mutantes desarrollados posteriormente, se aplicaron dosis selectivas de 15 y de 20 % de PEG-6000 por 14 días.

Se comparó el ITR de ocho caracteres morfofisiológicos, para analizar su posible utilidad como descriptores de la respuesta in vitro frente a estrés hídrico en portainjertos cítricos. Se obtuvo cuatro de ellos (la altura de la planta, la necrosis foliar, la necrosis del ápice radicular y el estrechamiento de las raíces, fueron diferentes del control (figura 3), sugiriendo su utilidad para la selección de genotipos con tolerancia al estrés hídrico in vitro.

Con el fin de corroborar estos resultados, se necesitan estudios adicionales para evaluar la correlación de estos caracteres con la supervivencia ex vitro de las plantas, así como su comportamiento en ensayos de estrés hídrico en condiciones controladas y en campo.

3. Selección in vitro de posible tolerancia a alcalinidad:

El cambio climático, no solo provoca la sequía. El incremento de las temperaturas, combinadas con el

mal manejo de la fertilización y la calidad del agua de riego, han conllevado a la alcalinización de algunos de estos, como es el caso de la región de Jagüey Grande, importante zona citrícola del país. Los suelos alcalinos inducen una fuerte clorosis férrica, que afecta principalmente a los portainjertos trifoliados. Por ello, se inició un estudio para establecer un esquema de selección in vitro de mutantes con posible tolerancia a la alcalinidad.

La solubilidad del hierro está muy influenciada por el pH del suelo. En condiciones ácidas predomina la forma ferrosa (Fe²⁺) que es soluble; mientras que en medio alcalino, el Fe²⁺ es oxidado a la forma férrica (Fe³⁺), que precipita como óxidos e hidróxidos disminuyendo su biodisponibilidad. Bajo este principio, en muchos estudios de evaluación de portainjertos cítricos y de otros frutales [12[12] MARTÍNEZ CUENCA M.R., QUIÑONES A., FORNER GINER MA. Screening of ‘King’ mandarin (Citrus reticulata Blanco) × Poncirus trifoliata ((L.) Raf.) hybrids as citrus rootstocks tolerants to iron chlorosis. 2016. Scientia Horticulturae. 2016; 198: 61-69. doi: 10.1016/j.scienta.2015.10.038.] se ha utilizado como método selectivo, un medio deficiente de hierro. En este trabajo se diseñó un esquema de selección in vitro con tres tratamientos: control, intermedio y deficiente de hierro en el portainjertos citrumelo Swingle.

Con respecto a los caracteres evaluados, se observó que la altura de la planta y el número de raíces mostraron una afectación en función del déficit de hierro a partir de los 21 y 28 días de estrés, respectivamente (figura 4 A y B). En este ensayo in vitro, la clorosis en hojas se manifestó como un aclaramiento del color verde en los espacios entre las nervaduras. El grado de clorosis tuvo un incremento marcado a partir de los 14 días y también en función del déficit de sales de hierro en el medio (figura 4 C y D). Por otra parte, la supervivencia de las vitroplantas a los 30 días de retirado el estrés fue de 87, 73 y 53 % para el control, el medio ½ Fe y el medio 0 Fe, respectivamente, indicando que el medio MS sin sales de hierro (0 Fe) puede ser utilizado como medio selectivo para el desarrollo de lotes de líneas mutantes.

4. Líneas mutantes en evaluación:

Las líneas mutantes desarrolladas serán evaluadas frente a estrés hídrico, en condiciones semicontroladas y de campo. Para ello, además de los lotes obtenidos por enraizamiento de los brotes adventicios [1[1] KHARKWAL MC. History of plant mutation breeding and global impact of mutant varieties. In: Mutation Breeding for Sustainable Food Production and Climate Resilience. Singapore: Springer, 2023. p. 25-55. Disponible en: https://doi.org/10.1007/978-981-16-9720-3_2 ], se generaron nuevos lotes injertando las líneas obtenidas. Esto permite acelerar su desarrollo y entrada en madurez reproductiva, obtener líneas mutantes regeneradas a partir de semilla y evaluar el comportamiento de su sistema radicular pivotante. Por otra parte, es importante identificar si existen variantes con arquitectura reducida (menor altura, mayor relación D/A, menor largo promedio de entrenudos) pues estas son de interés para las plantaciones de alta densidad, como una de las estrategias de la nueva citricultura frente al HLB.

En diciembre de 2020 se sembraron las primeras 39 líneas mutantes en parcela experimental J-10, de la UCTB “Félix Duque”, Jagüey Grande, Matanzas. A finales de 2022 dos líneas mantuvieron una mayor relación D/A, mientras que otras cuatro resultaron de interés por el acortamiento de los entrenudos. De ellas, una línea de citrange Carrizo resultó de interés por ambas características (bajo porte y entrenudos más cortos) (figura 5). Estos caracteres deben seguirse monitoreando a lo largo del desarrollo vegetativo de las plantas. Desde el punto de vista fitopatológico, se sigue el comportamiento de cinco líneas que mantienen menor incidencia de plagas y menos síntomas de enfermedades.