El uso de la Energía Nuclear en el campo de la ciencia y la tecnología animal en nuestro país se ha orientado fundamentalmente a la aplicación de técnicas de diagnóstico de estados funcionales y/o patológicos y a la corrección de la condición sanitaria de productos de origen animal. En este sentido las técnicas de los inmunoensayos han contribuido al conocimiento de la endocrinología veterinaria y fundamentalmente en la reproducción animal [1[1]. ALGARRA M, GÓMEZ D, ESTEVES DA SILVA J. Current analytical strategies for C reactive protein quantification in blood. Clin Chim Acta. 2013; 16(415): 1-9.]. En los últimos años, con el fin de poder establecer los perfiles hormonales en sangre, se han venido desarrollando múltiples técnicas que establecen el uso de isótopos radiactivos en la determinación de hormonas como son: el radioinmunoanálisis (RIA) y el inmunoradiométrico (IRMA) [2[2]. ANDRADE MA. Metodologías en el laboratorio clínico: el inmunoensayo. Ed.Universidad Santiago de Compostela, 2006.]. Estas técnicas, que constituyen un medio altamente específico y sensitivo para medir hormonas en suero, plasma, leche y otros líquidos corporales; han ayudado a aumentar el conocimiento de eventos endocrinos y metabólicos que ocurren durante el estrés, enfermedades, ciclos reproductivos, crecimiento y desarrollo [3[3].Hartbiomedica. Historia y aplicación de los Kits de RIA. http://www.hartbiomedica.com/es/noticias/item/28-historia-y-aplicacion-de-los-kit-ria.html. 2015.].
En este sentido, el siguiente trabajo está dirigido a destacar los procedimientos básicos de estas técnicas y su aplicación práctica en la reproducción animal.
Técnica inmunológica propuesta en 1959 por Yallow y Berson, que permite la cuantificación exacta de compuestos biológicos presentes en el organismo en concentraciones tan bajas como ng/ml (nanogramo=10-9g) o pg/ml (picogramo=10-12g). El radioinmunoanálisis requiere de cuatro componentes fundamentales y de cinco procesos básicos [2[2]. ANDRADE MA. Metodologías en el laboratorio clínico: el inmunoensayo. Ed.Universidad Santiago de Compostela, 2006.]. Dentro de los componentes tenemos; Ligando marcado radiactivamente o trazador: Debe ser marcado sin perder su inmunoreactividad y poseer alta pureza. El I125 es el isótopo más usado debido a su vida media de 60 días, posee un exceso de energía y para ganar estabilidad se desintegra emitiendo fotones gamma (γ), el cual puede medirse en un contador de centelleo sólido (figura 1) [3[3].Hartbiomedica. Historia y aplicación de los Kits de RIA. http://www.hartbiomedica.com/es/noticias/item/28-historia-y-aplicacion-de-los-kit-ria.html. 2015.]. Anticuerpo específico o ligador: A través de anticuerpos (AC) policlonales y monoclonales) encontrándose en una cantidad constante y limitante, capaz de interaccionar con el Ag [2[2]. ANDRADE MA. Metodologías en el laboratorio clínico: el inmunoensayo. Ed.Universidad Santiago de Compostela, 2006.]. Estándares: Son cantidades conocidas del ligando o analito que se desea medir. Muestra: Contendrá el analito no marcado que será medido y es análogo o idéntico al ligando empleado como estándar. [4[4].LARISSA R, IRIS L, VÁZQUEZ AM, VIRIDIANA M, MARTÍNEZ JJ. Técnicas inmunológicas.http://mesa54dinmuno.blogspot.com.ar/2009/05/tecnicas-inmunologicas.html; 11:54:26, 2015.]
En los procesos del RIA tenemos varios pasos que se inician con la reacción del RIA, donde el ligando marcado (trazador) y el no marcado compiten entre sí para unirse al Ac hasta alcanzar el equilibrio de reacción, con la formación de los correspondientes complejos Ag-Ac; a partir de esta reacción puede determinarse la radioactividad presente en los complejos inmunes, y asociarlos con las concentraciones de los entandares empleados. (Figura 2) [5[5]. HERNÁNDEZ C, CURE C, HERNÁNDEZ J. Fundamentos prácticos de la dosificación hormonal. Salud Uninorte. 1988; 1 (1).]. El proceso de incubación tiene una duración de 2-24 horas, con una temperatura que varía de 4 - 37 ºC, dependiendo del Ac utilizado y el método empleado con la finalidad de establecer un estado de equilibrio entre el trazador y el ligando no marcado en su unión con el Ac [2[2]. ANDRADE MA. Metodologías en el laboratorio clínico: el inmunoensayo. Ed.Universidad Santiago de Compostela, 2006.].
Se produce la separación de las fracciones libre y unida que ocurre por la migración diferencial y la precipitación de los inmunocomplejos formados. El último paso implica la medición de la radioactividad realizándose el conteo de las radiaciones que se expresa mediante la fórmulacpm (cuentas por minutos) de la muestra - cpm de la UNE (unión no específica) x 100=% de Unión Específica cpm totales [5[5]. HERNÁNDEZ C, CURE C, HERNÁNDEZ J. Fundamentos prácticos de la dosificación hormonal. Salud Uninorte. 1988; 1 (1). y 6[6]. URQUETA B, FERRANDO G. Aplicaciones del radioinmunoanálisis en producción animal y medicina veterinaria en el país. Revista académica de la Universidad de Chile.1985; 7(1).]:
Este conteo es la forma de conocer las concentraciones de las muestras problema que se expresan a través de la respuesta producida en la curva estándar que es esencial para el análisis de los datos (figura 3) [6[6]. URQUETA B, FERRANDO G. Aplicaciones del radioinmunoanálisis en producción animal y medicina veterinaria en el país. Revista académica de la Universidad de Chile.1985; 7(1).].
En el plano internacional se ha venido desarrollando disímiles investigaciones con el empleo del radioinmunoanálisis en las diferentes especies domésticas, fundamentalmente en el campo de la reproducción animal. Se han realizado estudios acerca de la caracterización hormonal del ciclo ovárico de las especies equina y bovina. [5[5]. HERNÁNDEZ C, CURE C, HERNÁNDEZ J. Fundamentos prácticos de la dosificación hormonal. Salud Uninorte. 1988; 1 (1). y 6[6]. URQUETA B, FERRANDO G. Aplicaciones del radioinmunoanálisis en producción animal y medicina veterinaria en el país. Revista académica de la Universidad de Chile.1985; 7(1).]. En yeguas se ha analizado el comportamiento de estrógenos y progestágenos, donde el comportamiento de los estrógenos en ciclos normales (2º post parto) varía con valores de 50-250 pg/ml en dependencia del momento del ciclo en que se encuentra. Los progestágenos en ciclos normales los valores descienden progresivamente, desde 15 ng/ml hasta por debajo de 1ng/ml al memento del celo en un período de 9-11 días, mientras que las hembras sincronizadas los valores de progesterona (P4) descienden drásticamente en las primeras 48h [4[4].LARISSA R, IRIS L, VÁZQUEZ AM, VIRIDIANA M, MARTÍNEZ JJ. Técnicas inmunológicas.http://mesa54dinmuno.blogspot.com.ar/2009/05/tecnicas-inmunologicas.html; 11:54:26, 2015.]. En el bovino se ha estudiado que la actividad ovárica expresa valores de P4 sérica dentro de rangos normales que fluctúan entre 0,45 y > 2,4 ng/ml a lo largo del ciclo [5[5]. HERNÁNDEZ C, CURE C, HERNÁNDEZ J. Fundamentos prácticos de la dosificación hormonal. Salud Uninorte. 1988; 1 (1).]. Otra línea de investigación es la utilización del RIA lácteo de P4 para obtener un diagnóstico temprano de gestación, donde el principal problema para la adaptación de la técnica del RIA sanguíneo al análisis lácteo es el rapto del glóbulo de grasa de la leche a la P4. Al superar el problema con la metodología propuesta por estos investigadores se pudo obtener que los valores significativos de preñez variaran entre 14,24 ng/ml y 26,25 ng/ml para los 15 y 60 días de preñez, siendo el valor promedio para no preñadas a los 15 días post-celo de 6,88 ng/ml. Se demostró una estrecha y significativa correlación positiva entre el valor de progesterona láctea y días de preñez (r = 0,97) [6[6]. URQUETA B, FERRANDO G. Aplicaciones del radioinmunoanálisis en producción animal y medicina veterinaria en el país. Revista académica de la Universidad de Chile.1985; 7(1).].
[6[6]. URQUETA B, FERRANDO G. Aplicaciones del radioinmunoanálisis en producción animal y medicina veterinaria en el país. Revista académica de la Universidad de Chile.1985; 7(1). y 7[7]. GATICA JL, CARVAJAL S, URQUIETA B, FERRANDO G. Aplicación de PGF2α y GNRH en yeguas F.S. de Carrera. IV Congreso Nacional de Medicina Veterinaria. Chillán, Chile, 1982.] Posteriores estudios en el campo de esta técnica, realizados por otros autores, aunque con procedimientos diferentes, han demostrado su eficiencia en el diagnóstico positivo de gestación a 21 días de 94,1% con un 90% de certeza en el diagnóstico de negativos a preñez.
[7[7]. GATICA JL, CARVAJAL S, URQUIETA B, FERRANDO G. Aplicación de PGF2α y GNRH en yeguas F.S. de Carrera. IV Congreso Nacional de Medicina Veterinaria. Chillán, Chile, 1982.] Los estudios realizados para el diagnóstico temprano de gestación y detección temprana de microabortos en equino fina sangre de carrera han indicado que en yeguas con preñez normal los valores de P4 sérica varían entre 6,21 ng/ml y 18,30 ng/ml, y en el caso de producirse aborto estos valores caen notoriamente a valores de 0,60 ng/ml a los 40 días post-monta. En base a estos resultados se han realizado estudios tendientes a corregir, mediante terapia de restitución la caída en los valores de P4 pretendiendo de este modo evitar la ocurrencia de aborto. Por otra parte, se ha trabajado en el seguimiento de terapias de reemplazo hormonal en equinos de carrera castrados, donde [8[8]. MARTINEZ R, URQUIETA B, ALTIERI E, GARZON L. Efecto de Castración y Terapia de Restitución sobre Niveles Plasmáticos de Testosterona y Algunos Parámetros Sanguí neos en Equinos F.S. de C. XXVI Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Chile. Punta de Tralca, Chile, 1983.] logró restituir los valores de pre castración independientemente de la dosis de testosterona utilizada, demostrándose que la dosis de 0,5 g permitió alcanzar la concentración plasmática de la hormona más cercana a la normal, manteniéndose ésta por un período de 2 semanas. Es importante la utilización correcta de las técnicas de RIA ya que permite controlar las concentraciones hormonales durante los tratamientos evitando los excesos que podrían alterar el estado de salud de los animales tratados.
[9[9]. ENCISO M, PÉREZ R, HUAMÁN H, CÁRDENAS O, HUANCA W. Determinación de leptina y sus valores séricos en alpacas hembras adultas con diferente condición corporal. Rev. investig. vet. Perú. 2007; 18(2). ISSN 1609-9117.] Estudiaron los niveles de leptina en alpacas adultas con el empleo del RIA para cuantificar sus valores y relacionarlos con la condición corporal, evidenciando la presencia de leptina en alpacas con una media de 17.23 ± 0.81 ng/ml.
En Cuba se ha venido desarrollando de forma sostenida desde los años 80 hasta la actualidad numerosas investigaciones con el empleo del radioinmunoanálisis en las diferentes especies domésticas, autores como [10[10]. MORALES RJ, MIKA, J, HOLY L, Y MENÉNDEZ A. Conducta reproductiva de las hembras – Holstein x ¼ Cebú. VI Resultados de la inseminación artificial pospartal, período de servicio e interpartal. Rev. Cub. Reprod. Anim. 1983; 10(2).] han estudiado la conducta reproductiva de la hembra – Holstein x ¼ Cebú y los valores de P4 y Hormona Luteinizante (LH) en el postparto, obteniendo como resultado que en los dos primeros meses del posparto los niveles de P4 fueron basales menor de 1ng/ml o no registrables, aumentando a medida que transcurrieron los días. Por otra parte, en los 2 o 3 días antes del celo se produjo un pico alto precedido de una ovulación con valores de 1 y 12ng/ml. Y la LH se comportó de forma similar que la P4 durante el estudio, alcanzando niveles de 40.6ng/ml.
En los avances de las investigaciones con el uso de las técnicas de RIA, [11[11]. MARTÍNEZ G, SOLANO R., CARAL J, RICARDO E, Y MIKA J. Estudio del comportamiento reproductivo de un rebaño de hembreas Cebú. III. Ciclo estral. Rev. Cub. Reprod. Anim. 1984; 10(2).] realiza un estudio del comportamiento reproductivo de un rebaño de hembras Cebú y evalúa el ciclo estral. Analiza el comportamiento sexual de la Holstein en las condiciones climáticas de Cuba y las variaciones estacionales de la P4 y la LH durante ciclos sucesivos en novillas. [12[12]. SOLANO R, FERNÁNDEZ O, Y MARTÍNEZ G. Comportamiento sexual de la hembra Holstein en las condiciones climáticas de Cuba. II. Variaciones estacionales de la progesterona y de hormona luteinizante durante ciclos sucesivos en novillas Holstein. Rev. Cub. Reprod. Anim. 1987; 13(1).] Realiza un análisis del perfil de la P4, frecuencia de fertilidad, no fertilidad y alteraciones del desarrollo del embrión en vacas Holstein. [13[13]. PEDROSO R, PÉREZ E, NUÑEZ D, STABLE J, FELIPE N. Diagnóstico de algunas causas de repeticiones del cello en vacas Holstein usando las dosificaciones de progesterona en leche por radioinmunoanálisis. Rev. Cub. Reprod. Anim. 1989; 15(2).] Realizan estudios sobre el perfil de hormonas tiroideas (T3 y T4) en vacas Holstein fértiles y repetidoras del servicio durante el ciclo estral determinando las variaciones de estas hormonas de acuerdo a la época del año. [14[14]. PÉREZ E, PEDROSO R, GONZÁLEZ N., STABLE J, ORTIZ R, FELIPE N. Perfil de hormonas tiroideas T3 y T4 en vacas Holstein fértiles y repetidoras del servicio durante el ciclo estral. Resúmenes VIII Jornada Interna en el XX Aniversario de su fundación. Cima, 1989.] Realizaron diagnóstico de preñez positiva en cabras mediante la dosificación de P4 en suero sanguíneo, obteniendo un 2.6% de ciclos anovulatorios y un 77.4% de preñez positiva con niveles de 6.20±2.0 nmol/l y un 95.7% en diagnóstico de preñez negativo. El 4.3% detectando falsos negativos y el 22.6% falsos positivos. [15[15]. CARMENATE C, PEDROSO R, GONZÁLEZ N, AVENICIBIA J, ALVAREZ T. Diagnóstico de preñez en cabras mediante la dosificación de Progesterona en suero sanguíneo. Resúmenes VIII Jornada Interna en el XX Aniversario de su fundación. Cima, 1989.] Evaluaron el efecto del flushing en la reproducción de las ovejas Pelibuey en el período de sequía, donde los resultados indican que la P4 plasmática se mantuvo similar en los grupos control y los analizados (2.34 y 2.28 nmol/l) indicando una baja actividad del ovario. [16[16]. ACOSTA J, LIMA T, VERDURA N. Flushing en la reproducción de las ovejas Pelibuey en el período de sequía. Rev. Cub. Reprod. Anim. 1996; 22(2).] Estudiaron la relación entre la condición corporal y la actividad ovárica de hembras bovinas en condiciones de pastoreo para evaluar el estado anéstrico mediante el examen clínico y los niveles de P4, donde las concentraciones de P4 ˃ 3.18nmol/l fueron utilizadas como referencia para discriminar la existencia de un cuerpo lúteo.
Gracias a estas investigaciones realizadas se obtuvieron resultados relacionados con las ciencias básicas, fundamentalmente en el campo de la fisiología reproductiva que permitieron la caracterización de los eventos reproductivos en las diferentes razas y cruzamientos que se establecieron por la política genética del país. Sirviendo como antecedentes para futuras investigaciones en el empleo de las técnicas nucleares con fines pacíficos dentro de la ganadería.
Es una técnica de tipo no competitivo utilizado en la cuantificación de Ag de alto peso molecular que presentan varios determinantes antigénicos ó epítopes. Este ensayo no puede emplearse en la determinación de moléculas pequeñas (ej. esteroides) que poseen baja capacidad antigénica, ya que en general se requiere que posean varios epítopes. Este procedimiento requiere de dos Ac específicos: el monoclonal marcado y el heteroclonal unido a fase sólida, los cuales se encuentran dirigidos contra epítopes diferentes del Ag, figura 4 [6[6]. URQUETA B, FERRANDO G. Aplicaciones del radioinmunoanálisis en producción animal y medicina veterinaria en el país. Revista académica de la Universidad de Chile.1985; 7(1).].
Las características del Ac marcado para su uso en el análisis IRMA son las siguientes: Alto grado de inmunorreactividad, actividad específica media, gran pureza radioquímica y larga estabilidad [6[6]. URQUETA B, FERRANDO G. Aplicaciones del radioinmunoanálisis en producción animal y medicina veterinaria en el país. Revista académica de la Universidad de Chile.1985; 7(1).]. Las características de la fase sólida son: El porcentaje de unión del anticuerpo a la celulosa debe ser aproximadamente un 50%, larga estabilidad y al momento de utilizar la suspensión en el ensayo ésta debe ser homogénea [17[17]. PEDROSO R, ROLLER F. Efecto de la condición corporal sobre la fertilidad de las vacas mestizas Holstein x Cebú en clima tropical. Rev. Cub. Reprod. Anim. 2004; 30(1 - 2).].
A nivel internacional diferentes autores [18[18]. GRAÑA A. Efecto local del cuerpo lúteo sobre la calidad embrionaria y funcionalidad uterina durante la gestación temprana en ovinos. Tesina para optar por el grado de Licenciado en ciencias biológicas. Laboratorio de endocrinología y metabolismo animal. Facultad de veterinaria, Universidad de la República. Montevideo, Uruguay, 2017. y 19[19]. FERNÁNDEZ-FOREN A., ABECIA JA., VÁQUEZ MI, FARCADA F, SARTORE, I., CARRIQUIRY, M., MEIKLE, A., SOSA, C. restricción alimenticia en ovinos: respuesta endocrina metabólica dependiente de las reservas corporales. ITEA. 2011; (4): 257-271.] realizaron un estudio para analizar las concentraciones de IGF1 e insulina en el plasma, útero y fluido uterino en la especie ovina con valores de 1.2ng/ml, 0.5ng/ml y 0.4ng/ml respectivamente. Para la insulina la sensibilidad del ensayo en plasma y fluido uterino fue de 1.3 µUI/ml y en útero fue de 4.3 µUI/ml.
En Cuba esta técnica no ha sido utilizada en la reproducción animal por la dificultad que presenta para la detección de moléculas de bajo peso molecular como los esteroides.
La imagen nuclear molecular con anticuerpos mar cados puede contribuir significativamente a la person alización de la inmunoterapia y la radioinmunoterapia, permitiendo una mejor selección de los pacientes, así como su seguimiento. El inmuno-PET es una herramienta poderosa, debido a los beneficios que brinda en la mejor visualización de lesiones, sobre todo pequeñas, y la cuantificación de las imágenes. El SPECT, a pesar de tener menor resolución espacial, puede brindar una alternativa teranóstica importante en aquellos lugares, donde aún no exista tecnología PET. La multimodalidad ha potenciado las aplicaciones de los radioinmunoconjugados en la medicina moderna.