CIENCIAS NUCLEARES
Modificación del hR3 con DOTA-NHS. Marcaje con 90Y y biodistribución
hR3 modification with DOTA-NHS. 90Y labeling and biodistribution
Dianelys Ondarse Álvarez1, Rene Leyva Montaña2, Minely Zamora Barrabí2, Luis Ducat Pages2, Ignacio Hernández2,
Luis Michel Alonso2
1Universidad de Matanzas, Autopista a Varadero, km 3½, Matanzas 44740, Cuba
2Centro de Isótopos, (CENTIS) AP 3415 San José de las Lajas (Cuba)
dianelys.ondarse@umcc.cu
RESUMEN
En el trabajo se reporta la conjugación y biodistribución del radioinmunoconjugado -DOTAhR3.
Se empleó el ácido 1, 4, 7, 10 tetraazaciclododecano N, N’, N’’, N’’’ tetraacético (DOTA)
como agente quelatante bifuncional (AQB) y se estudiaron las relaciones molares 320:1, 160:1
y 88:1 DOTA/anticuerpo monoclonal (hR3), evaluándose su influencia en la integridad del conjugado
y la eficiencia de marcaje. La estabilidad in vivo de los radioinmunoconjugados
-DOTAhR3
se determinó en ratas Wistar sanas a las 4, 24 y 48 horas. Los estudios de estabilidad
realizados mediante reto versus ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) demostraron que el
compuesto es estable en un amplio intervalo de tiempo (hasta 216 h). Los estudios de estabilidad
in vivo basados en la captación en hueso del radioinmunoconjugado demostraron que no es
apreciable la pérdida del radiometal en el radioinmunoconjugado hasta las 48 horas.
Palabras claves: itrio 90, reglas de embalaje, anticuerpos monoclonales, in vivo
ABSTRACT
The conjugation, characterization and biodistribution of -DOTA-hR3 radioimmunoconjugate
are reported in this work. DOTA was used as bifunctional chelating agent. Molar ratios 320:1,
160:1 and 88:1 DOTA/monoclonal antibody hR3 were studied in order to evaluate their influence
on the integrity of conjugate and labeling effi ciency. In vivo stability of
-DOTA-hR3 radioimmunoconjugates
was determined in healthy Wistar rats at 4, 24 and 48 h after the injection. Stability
studies performed by means of DTPA challenge showed that the compound is stable in a wide
period of time (up to 216 h). In vivo stability studies, based on the bone uptake, showed that the
radiometal release from the radioimmunoconjugate is not signifi cant in the first 48 hours.
Key words: yttrium 90, labelling, monoclonal antibodies, in vivo
Introducción
En la actualidad el empleo de anticuerpos monoclonales
continúa ganando popularidad como plataforma
para la radioinmunoterapia (RIT) de cáncer. Los radiofármacos para terapia involucran moléculas
con afinidad por blancos específicos acopladas
a radionúclidos [1-6]. Los ligandos aminocarboxilatos
como el DTPA, el DOTA y sus análogos son los
agentes quelatantes más empleados para acomplejar
radiometales con número de oxidación 3+
como el [7-10].
En el trabajo se reporta la preparación y caracterización del radioinmunoconjugado -DOTA-hR3,
así como su estudio de estabilidad in vitro y biodistribución en ratas Wistar sanas. De los resultados se sugiere que el
-DOTA-hR3 puede ser un candidato
potencial para su empleo en procedimientos
radioinmunoterapéuticos.
Materiales y Métodos
Reactivos y equipos
El hR3 (5 mg/mL), fue suministrado por el Centro
de Inmunología Molecular (CIM). El se obtuvo en forma de
a partir de un generador de
/
fabricado en el Centro de Isótopos (CENTIS).
El DOTA se adquirió de Macrocyclics Dallas TX. El patrón de punto isoeléctrico y el de peso molecular
fueron suministrados por Bio-Rad. Se utilizó
un sistema modular de HPLC Shimadzu equipado
con bombas LC-10, detector SPD-6AV, detector
radiométrico Berthold (Alemania) y columna Protein
Pack SW300 Waters (7,5 X 300 mm, 10 μm,
Waters). La electroforesis SDS-PAGE se realizó
en un equipo con fuente de alto voltaje (Mini-PROTEAN® 3 Cell) y la determinación del punto isoeléctrico
se desarrolló en un equipo PhastSystem. La
medición de la actividad se realizó en un contador
de centelleo líquido LKB-WALLAC-RacBeta 1209,
Finlandia) y en un calibrador de dosis CMR 35C
(Capintec, EE.UU.). En procesamiento estadístico
se utilizaron los paquetes estadísticos de MS Excel.
Se aplicaron métodos no paramétricos; se utilizó el
test de Kolmogorov-Smirnov con un nivel de significación
= 0,05.
Conjugación del hR3 con DOTA-NHS
Se trabajó con las relaciones molares (88:1,
160:1 y 320:1) DOTA/hR3, donde para 10 mg de
hR3 en solución se pesaron 5,6 mg, 8,1mg y 20 mg
de DOTA. Al DOTA sólido se le añadieron 400 μL
de buffer fosfato 0,1M pH-8,5 y posteriormente se
le añadió el hR3. Luego se añadió NaOH 2M para
ajustar el pH hasta 8,5. La mezcla reaccionante se
incubó a 16 ºC durante toda la noche con agitación
en un Vortex. Los inmunoconjugados se purificaron por columna PD-10 calibrada con aproximadamente 20 mL de buffer acetato de amonio ((ac))
0,1 M (1,0% HSA) pH-7,0 purificado. La elusión se
llevó a cabo igualmente con buffer
(ac). Para
determinar la concentración de los inmunoconjugados
se utilizó el método de Bradford [11]. Paralelamente
se midió la absorbancia del inmunoconjugado
obtenido a 280 nm, empleando el coeficiente de
extinción molar del hR3 (1,4), usando buffer fosfato
(0,01M) como blanco. Para determinar los agregados
de alto peso molecular, la pureza y la integridad
de los conjugados se utilizó HPLC de exclusión molecular (HPLC-EM).
Para realizar la electroforesis SDS-PAGE se
prepararon los geles de poliacrilamida al 12,5% (p/v), según el procedimiento descrito por Laemmli
(1970). La corrida electroforética se realizó en una
cámara BioRad (BioRad Cat. 1610318, Suecia).
Para realizar el isoelectroenfoque se prepararon
los geles embebiendo un Phastgel DYR en una
solución de 7,5% Pharmalyte 8-10,5 y 10% glicerol
durante 30 min con agitación. Además, se utilizó
el servicio on line del Instituto Europeo de Bioinformática
(EMBL WWW Gateway to Isoelectric Point
Service), para la estimación teórica de los puntos
isoeléctricos. Para determinar el número promedio
de moléculas de DOTA enlazados a una molécula
de hR3 se mezclaron 50 μL de una solución estandarizada
de Y(III) (1,4 x 10-4 μM, 7 nmol) que
contenía ~5,5 x 107 cpm/μL de ; 50 μl de buffer
acetato de amonio 0,5 M pH-7,0 y 50 μL del
conjugado DOTA-hR3 con relación molar DOTA/
hR3 160:1. La mezcla se hizo reaccionar por 3 horas
a 42 oC y posteriormente se le añadió 16 μL
de DTPA 10 mM pH-6 y se incubó 15 min zax a
temperatura ambiente. La mezcla de reacción se
analizó, utilizando cromatografía ITLC-SG (1 X
10 cm) y las mediciones se realizaron en un contador
de centelleo líquido (LKB-WALLAC-RacBeta
1209, Finlandia). La relación ligando/proteína (L/P)
se determinó con la expresión:
Marcaje de los inmunoconjugados
DOTA-hR3 con
En tubos Eppendorf se mezclaron alícuotas de (2-8 mCi, 2,5-5 μL) en una solución de HCl
0,05 N, 100 μL de buffer
0,5 M pH-7,0 y
100 μL del conjugado DOTA-hR3 según el caso. La mezcla de reacción se incubó a 42 °C por 1 h,
transcurrido este tiempo se le adicionó 1/9 del volumen
de reacción de una solución de DTPA 10 mM
pH-6,0 para acomplejar el
que no reaccionó y
se incubó por 15 min a temperatura ambiente. La
eficiencia de marcaje se determinó mediante cromatografía
ITLC-SG. Como fase móvil se usó una
mezcla de acetato de amonio (10% m/v) y metanol
(1:1). La medición del
se basó en el efecto Cherenkov. La purificación de los radioinmunoconjugados
se realizó de forma similar a la purificación de
los inmunoconjugados, pero la columna de purificación
y el resto de las operaciones se realizaron dentro
de una cabina de plexiglass con blindaje interno
como protección contra las radiaciones del
.
Estudio de estabilidad
del -DOTA-hR3 en reto contra de DTPA
La estabilidad del radioinmunoconjugado DOTA-
hR3 se evaluó en presencia de exceso de
DTPA. Una alícuota del conjugado radiomarcado (25-90 μL) con aproximadamente 2x
cpm de
se adiciona a 1 mL de DTPA 1 mM en solución salina
que contiene 1% HSA, pH 6,0; en estas condiciones
la relación molar DTPA/
-DOTA-hR3 fue
20800:1. Esta solución se incubó a 37 °C durante el
tiempo de estudio, y se analizó por HPLC de exclusión
molecular, utilizando como fase móvil 0,01 M
de buffer fosfato y 0,05%
a pH 7,0 en régimen
isocrático. Las muestras se analizaron en intervalos
de 0 a 216 h.
Estudio de biodistribución
del -DOTA-hR3
El producto del marcaje del anticuerpo con purificado se adicionó a una solución del anticuerpo
sin marcar hasta obtener una disolución de
533 μg/mL de anticuerpo y una concentración radiactiva de 66,7 MBq/mL.
Se utilizaron ratas Wistar machos, suministradas
por el Centro Nacional para la Producción de
Animales de Laboratorio (CENPALAB), en un rango
de masa corporal de 241,3 a 318 g. Se formaron
tres grupos experimentales de tres ratas cada
uno para ser sacrificados a tres tiempos diferentes
después de la administración, 4, 24 y 48 horas. Se
administraron en la vena marginal de la cola 0,3 mL
(20 MBq) de la disolución preparada para una dosis
de 160 μg de anticuerpo por animal.
Resultados
Conjugación del hR3 con DOTA
La concentración de los conjugados fue
2,0 mg/mL (1,36 ± 0,01) x 10-5 M y 2,1 mg/mL (1,48± 0,04) x 10-5 M determinada por el método directo y de Bradford respectivamente.
En la Fig.1 se aprecia el perfil cromatográfico
del inmunocojugado con relación molar 160:1 antes
y después de la purificación. Las relaciones molares
320:1 y 88:1 se comportan de manera similar,
por lo que para estas solo se muestran los cromatogramas
de los inmunoconjugados después de ser purificados.
En la Fig. 2 se muestran las placas electroforéticas SDS-PAGE en condiciones no reductoras (A) y reductoras (B).
El perfil electroforético de punto isoeléctrico (pI)
(Fig. 3 A) mostró valores para el hR3 nativo, dentro
del intervalo de valores reportados en sus especificaciones de calidad; valores de pI entre 8,1-8,7;
resultados que se comprobaron mediante la estimación
teórica de los pI a partir de su secuencia primaria
por el servicio on line del Instituto Europeo de
Bioinformática (EMBL WWW Gateway to Isoelectric Point Service) (Fig. 3B).
Marcaje del conjugado DOTA-hR3 con 90Y
Los resultados de la Tabla 1 no mostraron diferencias
significativas ( = 0,05) entre las formulaciones
320:1 y 160:1, sin embargo las diferencias
sí fueron significativas al comparar estas formulaciones con la formulación de 88:1 que mostró efi
ciencias de marcaje inferiores al 90%. Los resultados
de la pureza radioquímica mayor que 97% se corresponden con otros estudios [12], en los cuales se han alcanzado resultados superiores al 99%.
Determinación de la cantidad de grupos
DOTA enlazados a una molécula de hR3
Se obtuvieron alrededor de 14,1 ± 0,9 moléculas
de DOTA por cada molécula de anticuerpo monoclonal.
Estudio de estabilidad in vitro
Los resultados del estudio de estabilidad del radioinmunoconjugado
en relación molar DTPA/DOTA-
hR3 (20800:1) se muestran en la Fig.4.
Estudio de biodistribución
El objetivo fundamental del estudio de biodistribución fue determinar preliminarmente la estabilidad in vivo del radioinmunoconjugado. Los posibles sitios de acumulación del radiometal son el tejido óseo y el tejido hematopoyético. Tabla 2.
Se conjugó el DOTA-NHS con el hR3, aprovechando
la relativa facilidad que tiene el DOTA de
reaccionar con los grupos amino de los residuos
de lisina de las cadenas laterales del anticuerpo en
medio acuoso suavemente básico (pH 8-9). Con
anterioridad se había estudiado las relaciones molares
DOTA-NHS/hR3 en el intervalo 200:1 a 600:1,
obteniendo buenos resultados [13]. Tratando de
disminuir estas, se compararon tres proporciones diferentes, una dentro del intervalo ya estudiado y otras dos por debajo de este.
La purificación de los inmunoconjugados permite
separar adecuadamente las especies de alto
peso molecular de los contaminantes más ligeros
(DOTA en exceso y posibles fragmentos del anticuerpo),
evitando prolongados tiempos de purificación
por diálisis empleados por Lewis y cols [10].
La muestra purificada se caracterizó por HPLC. En
el espectro no se observa la presencia del AQBF
libre ni de agregados moleculares, lo cual es una
medida de la alta pureza del inmunoconjugado y
la conservación íntegra del anticuerpo después del
proceso de conjugación.
En la caracterización por electroforesis SDSPAGE,
se observó cómo mediante el tratamiento
de la muestra con 2 – mercaptoetanol fue posible
detectar la presencia de grupos DOTA acoplados al anticuerpo monoclonal. Esto se debe a que los
puentes disulfuro intra e intercatenario de las cadenas
pesadas tipo gamma y liviana tipo kappa y
lambda son disociados por la acción de este agente
reductor, permitiendo que se pierda la estructura
cuaternaria con mayor facilidad y se favorezca la
interacción del anticuerpo monoclonal distendido
en cadena peptídicas individuales con el SDS.
En la caracterización por isoelectroenfoque se
aprecia cómo a medida que aumenta la relación
molar DOTA/hR3 el punto isoeléctrico se hace menor
en magnitud. Ello muestra una posible relación
entre el número de grupos DOTA y la cantidad de
residuos lisina ocupados por este ligando que no
aportan carga a la determinación de pI. Los resultados
se comprobaron mediante la estimación teórica
de los pI a partir de su secuencia primaria por
el servicio online del Instituto Europeo de Bioinformática
(EMBL WWW Gateway to Isoelectric Point
Service). La Fig. 3 B muestra un comportamiento
similar al obtenido en la determinación experimental.
A pesar de que estos resultados no son aún
definitorios, se concluye que existe cierta relación
entre el número de grupos DOTA-NHS enlazados a
los residuos lisina del hR3 y el valor del pI, el cual disminuye sin afectar la identidad del anticuerpo monoclonal.
Estudios anteriores del conjugado DOTA-hR3
mostraron que con relaciones molares DOTA/hR3
en el intervalo 600:1-200:1, se obtienen eficiencias
de marcaje superiores al 90% [13]. Utilizando las
relaciones molares 320:1, 160:1 y 88:1, los resultados
de la Tabla 1 no mostraron diferencias significativas entre las formulaciones 320:1 y 160:1;
sin embargo, las diferencias sí fueron signifi cativas
cuando se compararon con la formulación de
88:1 que mostró eficiencias de marcaje inferiores
al 90%. Teniendo en cuenta este resultado se continuaron
los estudios con la formulación de 160:1,
debido a que es necesario emplear menor cantidad
de DOTA, mostrando resultados satisfactorios. En
la purificación de los radioinmunoconjugados se eliminan impurezas como el -DTPA, coloides marcados y
-Acetato.
La relación L/P estuvo en correspondencia con
lo obtenido en la determinación teórica del punto
isoeléctrico (Fig. 3 B); sin embargo, algunas publicaciones
señalan que un elevado número de AQB
unido al anticuerpo puede afectar su inmunoreactividad,
por lo que la evaluación de esta es prácticamente inevitable para caracterizar correctamente al radioinmunoconjugado.
Los resultados en la incubación del radioinmunoconjugado
en exceso de DTPA evidencian su estabilidad [14,17] para radioinmunoconjugados de este tipo. El que se encuentra libre puede ser
consecuencia de que parte de este no se haya enlazado
al DOTA y se haya acoplado a otros sitios en
el anticuerpo, en este caso el radisótopo se pudiera
desacoplar de estos sitios, cuyos enlaces son más
débiles que los enlaces con DOTA y transquelar al
DTPA que es un AQB con capacidad de acomplejar
rápidamente al radiometal.
En los estudios de biodistribución se aprecia (Tabla 2), que no existe una acumulación significativa
de radiactividad en ninguno de los órganos o tejidos
muestreados. Se discute acerca de la acumulación
del en tejido óseo cuando se presenta como impureza
o cuando se libera del radioinmunoconjugado
por inestabilidad del mismo [14,15]. Solamente
podemos apreciar un ligero aumento de la captación
esplénica y hepática que no supera el 1% de la dosis
por gramo de tejido, siendo el tejido donde, además,
se encuentra la mayor acumulación. Esto pudiera
explicarse porque la excreción de los anticuerpos
ocurre por vía biliar, por lo que al ser parte del radioinmunoconjugado
un anticuerpo monoclonal, es posible
que haya mayor captación hepática. De estos
resultados podemos aseverar que no existe una pérdida
del radionucleido que implique una captación indeseada en tejido no blanco.
Conclusiones
Se obtuvieron conjugados DOTA-hR3 en las relaciones molares 88:1, 160:1 y 320:1, a los cuales se le realizaron estudios de HPLC, electroforesis SDS e isoelectroenfoque, demostrándose que se preserva la integridad y pureza del inmunoconjugado. Los rendimientos de marcaje fueron superiores al 95% para la relación molar 160:1 y 320:1; la primera fue seleccionada como resultado de la aplicación del test Kolmogorov-Smirnov para continuar los estudios, debido a que emplea menor cantidad de DOTA. Los estudios de estabilidad realizados a la formulación seleccionada (160:1) hasta 216 h se basaron en estudios de reto contra DTPA, siendo la pureza radioquímica superior al 97%, y estudios de biodistribución, los cuales evidenciaron que el radioinmunoconjugado no presenta especial afinidad por ningún órgano sano, siendo los riñones, el bazo y el hígado los órganos donde se acumula el mayor porcentaje de actividad.
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Recibido: 14 de marzo de 2011
Aceptado: 28 de abril de 2011