CIENCIAS NUCLEARES
Nuevas curvas de calibración para la dosimetría biológica en Cuba
New calibration curves for biological dosimetry in Cuba
Ana Ilsa Lamadrid Boada, Tania Mandina Cardoso, Jorge Ernesto González Mesa, Ivonne Romero Aguilera, Omar
García Lima
Laboratorio de Radiobiología del Centro de Protección e Higiene de las Radiaciones (CPHR)
Calle 20 No 4113 e/ 41 y 47, Playa. La Habana, Cuba
RESUMEN
Se muestran 11 curvas dosis respuesta in vitro obtenidas por primera vez en el país para tres indicadores
biológicos: anillos en cromosomas prematuramente condensados (PCC-R) índice PCC; focos
gamma H2AX (-H2AX), todos ellos en linfocitos de sangre periférica humana. Estas curvas en su
conjunto cubren un intervalo de dosis desde 0,1 Gy hasta 25 Gy, y varias calidades de radiación,
así como varios tiempos post exposición, lo cual fortalece las capacidades para dar respuesta a las
emergencias radiológicas y amplía las posibilidades de contribuir al esclarecimiento de cualquier
suceso radiológico anormal que pueda ocurrir en la región, donde el indicador predominante en la
actualidad continúa siendo la cuantificación de dicéntricos en linfocitos de la sangre periférica.
Palabras claves: Cuba, dosimetría, calibración, indicadores biológicos, lesiones producidas por radiaciones, distribución de las dosis de radiación, dosis de radiación
ABSTRACT
In this paper we show the dose response curves in vitro obtained at first time in Cuba, with several
biological indicators for radiation damage: rings in premature chromosome condensation
(PCC-R); PCC index and -H2AX foci, all of these in peripheral human lymphocytes. These
curves cover an interval of doses between 0.1 Gy to 25 Gy, several radiation qualities and times
post-exposition, strengthening the capabilities of the Cuban laboratory to give answer to the
radiological emergencies and in the same way increase its contribution to elucidate any radiological
abnormal event take place at the region where the main indicator at the present time is the
dicentric assay in lymphocytes of peripheral blood.
Key words: Cuba, dosimetry, calibration, biological indicators, radiation injuries, radiation dose distributions, radiation doses
Introducción
Cuando ocurren accidentes radiológicos es importante
determinar lo antes posible la magnitud de las dosis que recibieron las personas afectadas. La
dosimetría biológica aporta frecuentemente criterios
importantes en la investigación del accidente.
Si la dosis recibida está por encima de 1 Gy, ayuda
a tomar decisiones sobre la terapia y da información
de los probables efectos determinísticos que
sobrevendrán. Si las dosis son menores el médico
podrá orientar al irradiado sobre los riesgos de los
efectos estocásticos a largo plazo, por ej. el riesgo
de desarrollar cáncer y por último, cuando la dosimetría
arroje una dosis menor de 50 mGy será muy
tranquilizador para la persona conocer que no se
ha encontrado un daño cromosómico significativo.
La dosimetría biológica consiste en la cuantificación del daño ocasionado por las radiaciones ionizantes
sobre las células del propio individuo, la
cual se compara con curvas dosis respuestas realizadas
in vitro y requiere que el parámetro medido
posea una relación dosis efecto conocida que perdure
el tiempo suficiente para ser observado, que
sea reproducible, de alta especificidad respecto
a las radiaciones; que abarque un cierto intervalo
de dosis; que la muestra sea de fácil recolección y
que los resultados se obtengan de manera rápida.
Mientras mayor número de esas características posea
el indicador medido, será más útil, confiable y preciso.
La dosimetría citogenética convencional utiliza
el dicéntrico para las estimaciones y es hasta el
momento la más precisa y confiable [1]. El intervalo
de dosis en que muestra mayor precisión es
entre 0,1 y 5 Gy, por encima de este, los dicéntricos saturan [2]. En la investigación de accidentes
radiológicos es importante disponer de una biodosimetría
segura para un espectro de exposición lo
más amplio posible, por ello se han comenzado a
desarrollar otros indicadores que vencen las limitaciones
del ensayo de dicéntricos, el cual ha mostrado
algunas limitaciones en las altas dosis y en
el tiempo de generación de sus resultados. Para
las altas dosis las investigaciones se han enfocado
en el ensayo de anillos en cromosomas condensados
prematuramente, más conocido por PCC-R,
el cual permite estimaciones de 20 y hasta 25 Gy
[3, 4], por encima de esa dosis ocurre la saturación
de los anillos. Sin embargo, es posible hacer
estimaciones a dosis aún mayores utilizando otro
indicador, el índice PCC [5, 6], si bien se necesitaría
confirmación en casos reales. También ha
comenzado a ganar espacio en los últimos años
el empleo de un indicador molecular muy sensible -H2AX, mediante el cual es posible detectar los
sitios con rupturas dobles en la molécula de ADN,
comúnmente denominados “focos
-H2AX” a dosis
tan bajas como 0,02 Gy [7, 8]. La ventaja de este
indicador es la inmediatez, pues para el análisis de
este no es necesario el cultivo celular, imprescindible
en el ensayo de dicéntricos y PCC-R, su limitante
es que su frecuencia disminuye rápidamente
con el tiempo, no obstante se ha demostrado que
a dosis altas es posible evaluar el indicador varias
horas después de ocurrida la exposición, por lo que
se ha desarrollado la estrategia de evaluarlo y obtener
curvas de calibración a diferentes tiempos post
exposición [9,10].
En el trabajo se muestran los resultados más
recientes obtenidos en el Servicio de Dosimetría
Biológica del CPHR. Se muestran 11 curvas dosis
respuesta in vitro elaboradas para cubrir el intervalo
de dosis entre 0,1 a 25 Gy de rayos gamma y hasta
4 Gy de neutrones. Estas incluyen una curva para
el ensayo dicéntricos en el intervalo de 0,1 a 5 Gy,
una curva de PCC-R y una del índice PCC con radiación
gamma para el intervalo de dosis entre 5 y
25 Gy. Una curva de PCC-R y una de índice PCC
con neutrones para el intervalo de 1 a 4 Gy, tres
curvas de -H2AX para rayos X en el intervalo de
0,1 a 2 Gy a 30 minutos, 5 horas y 8 horas postexposición
y tres de
-H2AX para radiación gamma
con 30 minutos, 8 horas y 16 horas post exposición.
Las curvas amplían las posibilidades existentes
en el país para estimar las dosis en los individuos
expuestos durante accidentes o incidentes
radiológicos.
Materiales y Métodos
Preparación de las muestras
Las extracciones de sangre se hicieron con jeringuillas
desechables con heparina de litio y dispensada
en tubos para su posterior irradiación. Los
donantes voluntarios dieron su consentimiento por
escrito y fueron informados de los fines de las investigaciones
acorde a la Ley No 41 del Ministerio de
Salud Pública de Cuba en caso de las irradiaciones
hechas en el CPHR. Para las irradiaciones realizadas
en el IRSN de Francia, la sangre fue colectada
acorde a la Ley de Bioética francesa (L 2004-800).
Irradiación de las muestras
En todas las irradiaciones realizadas se siguieron
las recomendaciones del Organismo Internacional
de Energía Atómica para la producción de
las curvas dosis respuesta in vitro [1]. La dosimetría
se expresó en términos de Kerma en aire.
Curva de dicéntricos y rayos gamma: las muestras
de sangre se irradiaron en una fuente de del Laboratorio Secundario de Calibración Dosimétrica
del CPHR, trazable al PTB de Alemania, a dosis de 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 0,75; 1,0; 2,0; 3,0; 4;0 y 5,0 Gy a una tasa de dosis de 1 Gy/min.
Curva de anillos e índice PCC en cromosomas
prematuramente condensados con irradiación gamma:
las irradiaciones se realizaron en las instalaciones ICO-4000 del IRSN, Francia con 60Co a dosis de 5; 7,5; 10; 20 y 25 Gy a una tasa de dosis de 0,5
Gy/min.
Curva de anillos e índice PCC en cromosomas
prematuramente condensados con irradiación con
neutrones: los tubos se expusieron a neutrones de
fisión en las instalaciones de SILENE (Valduc, Francia)
a dosis de 5; 7,5; 10; 20 y 25 Gy, la energía media del espectro de neutrones fue 0,49 MeV.
Curvas de -H2AX con rayos X: las irradiaciones
se realizaron en el CPHR en una fuente de rayos
X Pantak 160, 100 kVp, 10 mA, a una tasa de
dosis de 0,14 Gy/min. Las dosis suministradas fueron
0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 y 1 Gy para las curvas de 30 min, mientras que para 5 h y 8 h se suministraron dosis de 0,5, 1 y 2 Gy.
Curvas de -H2AX con
: las irradiaciones se
realizaron en las instalaciones ICO-4000 del IRSN,
Francia a dosis de 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 y 1 Gy
para las curvas de 30 min, mientras que para 8 h y 16 h se suministraron dosis de 0,5, 1 y 2 Gy a una tasa de dosis de 0,5 Gy/min.
Descripción del ensayo de dicéntricos
Después de la irradiación, las muestras de sangre
se mantuvieron a 37 °C durante 2 horas, permitiendo
actuar los mecanismos de reparación celular.
Los cultivos de linfocitos se hicieron con sangre
total en medio RPMI 1640, suplementado con
10% de suero bovino fetal y 1% de fitohemaglutinina,
incubándose a 37 °C durante 48 horas.
Se añadió colchicina 3 horas antes de terminar
el cultivo. Las células cultivadas se trataron con
una solución hipotónica de KCl (0,075 M) durante
30 minutos a 37 °C y se fijaron con metanol:ácido acético, 3:1 v/v. Finalmente, las células se
extendieron por goteo en láminas portaobjetos
y se colorearon con Giemsa. Cuatro operadores
participaron en el conteo, y la aparición de cromosomas
dicéntricos se comprobó por un segundo
operador. Se analizaron 500 metafases con
46 ± 2 centrómeros o 100 dicéntricos por cada dosis
de radiación cuando fue posible. Las frecuencias
de dicéntricos se calcularon como la relación
entre los dicéntricos encontrados entre el total de
metafases analizadas. Se utilizaron microscopios
Olympus, Japón, con 1000 aumentos. Para el
análisis estadístico se usó el test "U" para testar
si la dispersión de las aberraciones describía una
distribución de Poisson [11]. Las relaciones dosis
efecto se ajustaron acorde al modelo lineal cuadrático,
usando el método de la máxima verosimilitud descrito por Papworth [12].
Descripción del ensayo de PCC-R y del índice PCC
Después de la irradiación la sangre se mantuvo
a 37 °C durante 2 horas, permitiendo actuar los mecanismos
de reparación celular.
Los cultivos de linfocitos para las curvas de
PCC-R se hicieron con sangre total en un medio
de cultivo similar al utilizado para el ensayo de dicéntricos
con ligeras variantes: 20% de suero bovino
fetal, colcemid (0,05 μg/ml) a las 24 horas de
comenzar el cultivo y calyculina A (50 nM), 1 hora
antes de finalizar estos. El tratamiento hipotónico,
la fijación y la tinción fueron los mismos que para
los dicéntricos. Dos operadores participaron en los
conteos acorde al criterio de considerar como un
anillo aquel con un orificio visible en su centro (con
o sin centrómero visible) en cualquier estadio del
ciclo celular y las parejas de anillos separados o
unidos por su centrómero [4].
La frecuencia de anillos PCC se evaluó en células PCC en G1, G2 y M con más de 46 elementos.
Se analizaron como mínimo 100 anillos o
500 células PCC por cada dosis. Las frecuencias
de PCC-R en todos los estadios del ciclo celular
se calcularon como la relación entre los anillos
encontrados y el total de células observadas. Se
utilizó un microscopio Nikon SA, Japón, con 1000
aumentos. Para el análisis estadístico se usó el
test "U" para testar si la dispersión de las aberraciones
describía una distribución de Poisson [10].
Las relaciones dosis efecto se ajustaron acorde
al modelo lineal, usando el método de la máxima
verosimilitud descrito por Papworth [11]. El índice
PCC se calculó como el porcentaje de células
con cromosomas prematuramente condensados
entre todas las células observadas. Las células
PCC en fase S no se incluyeron en el cálculo de este [6].
Descripción del ensayo -H2AX
Se empleó la técnica de detección de focos -H2AX mediante inmunofluorescencia para monitorear
la formación de roturas de doble cadena en
linfocitos humanos aislados de muestras de sangre
no tratadas e irradiadas con rayos X y gamma según
la metodología descrita por Roch-Lefèvre et. al. [9].
El número de focos -H2AX/célula se determinó
en muestras controles e irradiadas de al menos 3
sujetos sanos para todos los tiempos de cinética
ensayados para ambos tipos de irradiación.
La sangre irradiada así como los controles se
diluyeron con RPMI y se incubaron a 37 °C durante
30 min, 5 h, 8 h y 16 h. Se aislaron las células mononucleares
mediante un gradiente de FICOLL, se
fijaron con paraformaldehído 2% durante 1 hora a
4 °C y después de varios lavados se extendieron
en las láminas mediante centrifugación. Se realizó
la inmunotinción y la captura y análisis de las células
y focos mediante los softwares Histolab™ y
el Cartograph™ (Microvision Instruments, FRANCE).
En el análisis estadístico para la elaboración de las curvas se cuantificó el número de focos por célula. Se calculó el promedio por dosis en cada caso. Se empleó un ajuste mediante regresión lineal para elaborar las curvas dosis-respuesta. Las curvas dosis-respuesta para 30 min y 8 h después de la irradiación se compararon con las obtenidas en el IRSN con rayos gamma, empleando un análisis de regresión y la prueba t de Student (p < 0,05).
Resultados y discusión
En la siguiente tabla se presentan los resultados de la realización de 11 curvas dosis respuestas elaboradas por los especialistas del Laboratorio de Radiobiología.
Curva dosis respuesta
para dicéntricos con irradiación gamma
Se analizaron un total de 11 129 metafases, en
un intervalo de dosis desde 0,2 Gy hasta 5 Gy que
sin considerarse una dosis tan alta, está en el límite
de la sobrevivencia humana. La formación de
dicéntricos siguió una distribución de Poisson. La
frecuencia base de dicéntricos es la obtenida con
donantes sanos analizadas anteriormente en el laboratorio, y similar a las reportadas por laboratorios de referencia en el mundo [13].
Se obtuvo una relación lineal cuadrática como
se esperaba, para células expuestas a irradiación con bajo LET, cuyos coeficientes se muestran en la tabla. Esta curva resultó similar a la que existía
anteriormente en laboratorio, los coeficientes eran
a = 0,028 y b = 0,047, aunque los errores son menores
en esta nueva edición de la curva, debido
probablemente a un mayor número de células analizadas.
La curva convencional de dicéntricos se aplica
en la evaluación dosimétrica inmediata de situaciones
de sobreexposición aguda a todo o gran parte
del cuerpo, por irradiación externa y/o contaminación
interna, con radionúclidos de distribución uniforme
en el organismo como cesio y tritio. Mediante
la aplicación de métodos estadísticos desarrollados
es posible realizar estimaciones en exposiciones
inhomogéneas, fraccionadas y prolongadas en el
tiempo, donde se tiene en cuenta el decrecimiento
en la frecuencia de aberraciones de manera exponencial
en función del tiempo [1]. Esta curva es de
amplio uso en Cuba, donde la mayoría de los trabajadores expuestos trabajan con fuentes de y
.
Curva dosis respuesta para PCC-R
con irradiación gamma
Se analizaron 5113 células PCC en estadios
G1, G2 y M en el intervalo de dosis de 5 a 25 Gy
de radiación gamma . Las frecuencias de anillos observados mostraron una relación lineal con
la dosis de radiación, lo cual concuerda con los modelos
planteados para la formación de aberraciones
cromosómicas para altas dosis [1] y con la frecuencia
de anillos obtenida con el mismo protocolo
de cultivo [14], pero inferior a la obtenida por otros
autores, probablemente debido a diferencias en los criterios de conteo [3]. Los coeficientes de la curva se muestran en la tabla. El ensayo es de utilidad en
casos de sobreexposiciones accidentales, donde
la dosis recibida por la víctima esté por encima de
5 Gy, pues este ensayo soluciona las principales
dificultades que presenta la técnica convencional
de dicéntricos a esas dosis que son la saturación
de los dicéntricos y el bajo índice mitótico de los cultivos [15].
Curva dosis respuesta para PCC-R
con irradiación con neutrones
Se analizaron 11 019 células PCC en estadios
G1, G2 y M en el intervalo de dosis de 1-25 Gy de
irradiación con neutrones de fisión. El ajuste de
las frecuencias de anillos observadas desde 0 a
3,8 Gy fue obtenido con el modelo lineal, como era
de esperarse para radiaciones de alto LET [1]. Los
coeficientes de la curva se muestran en la tabla. Esta
curva se puede utilizar para casos de sobreexposiciones
accidentales a neutrones, pudiendo obtenerse
estimaciones precisas hasta 4 Gy, aproximadamente.
El empleo de un amplio intervalo en las dosis de radiación
permitió una caracterizaron más precisa de la
respuesta a la dosis y el proceso de saturación.
Curvas dosis respuesta para
el índice PCC con irradiación gamma
e irradiación con neutrones
Los coeficientes de ambas curvas se dan en la
tabla. El valor de este indicador decreció de manera
dosis dependiente en el intervalo de 1-25 Gy. En
el caso de los neutrones permitió discriminar con
facilidad 3 grupos de dosis 0–1 Gy, > 1–10 Gy y> 10 Gy lo cual resulta de utilidad por el proceso
de saturación observado en la formación de anillos,
que limita las estimaciones de dosis para exposiciones
con neutrones extremadamente altas. El valor
del índice PCC menor que 1 indicó que la dosis de
radiación estuvo por encima de 10 Gy. Estos resultados
se obtuvieron en modelaciones in vitro. Los
datos obtenidos con este indicador se pueden emplear
dentro de la variante multiparamétrica junto a
otros indicadores biológicos, en la toma de decisiones
sobre el tratamiento médico necesario en cada
individuo y fundamentalmente, en la clasificación de
las personas irradiadas por niveles de exposición.
Curvas -H2AX con irradiación X y gamma
Los valores basales de focos -H2AX cuantificados para 30 min se encuentran en el intervalo entre
0,03 y 0,16, similar a lo reportado en la literatura
para rayos gamma [7-9].
Se observó un incremento lineal del número de
focos/célula con la dosis de radiación para los diferentes
tiempos estudiados. El número de focos/célula/Gy para rayos gamma fue 10,7; mientras que para
rayos X fue 11,66 al analizarse 30 minutos postexposición.
Estos resultados son similares a los descritos
en la literatura para un tiempo de 30 minutos de
incubación de la sangre a 37 °C [7,8,10].
Las curvas obtenidas con rayos X y radiación
gamma a 30 min no mostraron diferencias significativas (p > 0,05), contrario a lo observado 8 horas
post exposición (p < 0,05). El retardo en la cinética
de reparación después de la irradiación con rayos X
se pudiera atribuir a que la energía y el tamaño de
las trazas de partículas secundarias que esta radiación
produce es mucho menor que la de la radiación
gamma que es más energética, lo que resulta en una
elevada densidad electrónica local como sugiere
Beels, et. al. para bajas dosis [16] Esto no debe tener
implicaciones in vivo según Löbrich, et. al. [7] en estudios de irradiaciones parciales en pacientes.
Como se ha señalado, este indicador tiene la limitante
de que su frecuencia disminuye rápidamente
con el tiempo postexposición. Las curvas obtenidas
avalan la posibilidad de emplear el indicador
para detectar daños en el ADN hasta 16 h después
de exposiciones corporales uniformes a dosis desde
0,5 hasta 2 Gy. Ello permitiría evaluar en este
intervalo de dosis y tiempo personas con sospecha
de sobreexposición a las radiaciones ionizantes.
Actualmente se evalúa la posibilidad de extender
el intervalo de dosis y el tiempo, postexposición al
que se realiza el análisis, lo cual permitiría estimar dosis superiores a 2 Gy en intervalos de tiempo mayores.
Conclusiones
Las curvas dosis respuesta de los nuevos indicadores
incorporados al servicio de dosimetría
biológica permiten estimar dosis en un intervalo entre 0,1 Gy y 25 Gy para radiación gamma y entre
1 Gy y 25 Gy para irradiación neutrónica. Cubrir
este amplio intervalo de dosis con la dosimetría
biológica fortalece las capacidades del país para
dar respuesta a las emergencias radiológicas e
igualmente amplía las posibilidades de contribuir
al esclarecimiento de cualquier suceso radiológico
anormal que pueda ocurrir en la región, donde el indicador
predominante en la actualidad sigue siendo
la cuantificación de dicéntricos en linfocitos de la
sangre periférica.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la AENTA/CITMA
como parte de dos Proyectos Ramales Nucleares,
así como por el Proyecto Regional RLA9061 y el IRSN de Francia.
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Recibido: 1 de febrero de 2011
Aceptado: 28 de abril de 2011